ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN

Estudio histológico en callos de Stylosanthes guianensis cv. CIAT-184

Histological study in callus of Stylosanthes guianensis cv. CIAT-184

Leticia Fuentes¹, A.R. Mesa², María L. Ruíz³, María I. Peláez³ y Martha Fernández³

¹ CEBIO-Universidad de Matanzas «Camilo Cienfuegos» Autopista a Varadero km 3 ½. Matanzas, CP 44740, Cuba
E-mail: leticia.fuentes@umcc.cu
² EEPF «Indio Hatuey». Matanzas, Cuba
³ Facultad de Biología. Universidad de León, España

RESUMEN

Se realizó una evaluación histológica en callos de Stylosanthes guianensis cv. CIAT-184, obtenidos a partir de hipocótilos, hojas cotiledonales y hojas verdaderas, los cuales fueron cultivados en medio MS suplementado con 2,4-D y 6-BAP. Los explantes manifestaron diferencias en cuanto al nivel de desdiferenciación de los tejidos durante la callogénesis, así como variabilidad en la textura de los callos formados, dependiendo de la concentración hormonal. De los protocolos utilizados para la evaluación histológica, los mejores resultados se obtuvieron con: fijación con formol al 10%, deshidratación en serie alcohólica, inclusión en parafina y tinción con safranina-verde rápido. El desarrollo de tejido meristemático y la yema adventicia a partir de un grupo de células que mantiene comunicación con el resto del tejido, entre otras características, indica que los callos tuvieron una respuesta organogénica.

Palabras clave: Stylosanthes guianensis cv. CIAT-184, organogénesis, histología.

ABSTRACT

The histological evaluation was done in callus obtained from sections of hypocotyls, cotyledons and mature leaflets of Stylosanthes guianensis cv. CIAT-184, which were cultured on MS salts supplemented with 2,4-D and 6-BAP. Different levels of transformation were observed among the explants during the callus formation, as well as texture variability of callus in dependence of hormonal concentration. Of the used protocols, the best results were obtained with formol to 10%, dehydration in alcoholic series, paraffin inclusion and the staining with safranine-fast green. The meristematic region formation and adventitious bud development from a group of cell in callus surface, point toward organogenic callus transformation of the explants.

Key words: Stylosanthes guianensis cv. CIAT-184, organogenic callus, histology.

INTRODUCCIÓN

En el género Stylosanthes Sw se ubica un grupo de leguminosas forrajeras ampliamente utilizadas en la agricultura tropical y subtropical como banco de proteína, abono verde y, fundamentalmente, como cultivos forrajeros en asociaciones con gramíneas (Lovato y Martins, 1997). Algunas especies también pueden usarse como control biológico de la garrapata del ganado (Sutherst, Wilson, Reid y Kerr, 1998). Stylosanthes guianensis cv. CIAT-184 se ha introducido en varios países con excelentes resultados (Keoboualapheth y Mikled, 2003) y ha sido seleccionado como cultivar promisorio para desarrollar la ganadería en suelos ácidos y poco fértiles de Cuba.

Con el propósito de desarrollar un programa para obtener un germoplasma bien adaptado y con mejores niveles de resistencia a la antrac-nosis, Mesa, Lajonchere, Prieto y Toral (1993) determinaron las condiciones necesarias para la obtención de plántulas de este cultivar regeneradas in vitro. Varios autores han sugerido la utilización del cultivo de células y tejidos como complemento al trabajo de mejora del género (Consoli, Vieira, Lopes de Souza y Garcia, 1996), así como para la transformación genética directa de los explantes (Quecini y Vieira, 2001); sin embargo, en pocos casos (Dornelas, Vieira y Appezatto da Gloria, 1992) estos estudios se han acompañado de una evaluación histológica que permita caracterizar el proceso de desdiferenciación y rediferenciación de los tejidos.

En el presente trabajo se realizó una evaluación histológica del proceso de regeneración de callos de S. guianensis cv. CIAT-184 obtenidos a partir de tres explantes diferentes cultivados en medios suplementados con 2,4-D y 6-BAP.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se utilizaron plántulas que tenían 10 días de germinadas asépticamente en medio MS (Murashige y Skoog, 1962) libre de hormonas, en condiciones de iluminación natural. De ellas se tomaron secciones de hipocótilos (Hi), hojas cotiledonales (HC) y hojas verdaderas (HV), de aproximadamente 5 mm, utilizando un escalpelo estéril en una cámara de flujo laminar vertical. Los Hi fueron cortados por debajo del nodo donde se insertan las hojas cotiledonales y por encima del cuello. A las hojas se les eliminó la base, por donde se unen al pecíolo, y el ápice. Una vez seleccionados los explantes se colocaron en placas de Petri plásticas de « 29 mm, las cuales contenían 30 mL de medio nutritivo MS (Mura-shige y Skoog, 1962) suplementado con vitaminas del B5 (Gamborg, Miller y Ojima, 1968) y varias combinaciones de ácido-2,4-dicloro-fenoxiacético (2,4-D) con 6-bencilaminopurina (6-BAP), que se muestran en la tabla 1.

En esta etapa se evaluó el comportamiento de los explantes en los tratamientos iniciales, y se caracterizaron atendiendo al color, la textura y el grado de desdiferenciación del explante, según criterios de Pierik (1990).

Transcurridas seis semanas de cultivo en el medio de establecimiento, se subcultivó un fragmento de cada callo en frascos Erlenmeyer de 250 mL, que contenían medio de regeneración estéril constituido por sales MS, vitaminas B₅ y 3 mg de 6-BAP/L y 0,001mg de ácido-naftalena-cético (ANA)/L, según Mesa, A. (comunicación personal). Todos los medios fueron solidificados con 7 g de agar (Sigma)/L. El pH de los medios de cultivo fue ajustado a 5,8 antes de autoclavear a 121ºC durante 20 min. Se empleó un diseño completamente aleatorizado, con tres réplicas de cada tratamiento y 10 muestras en cada caso, en las cuales se evaluaron las siguientes variables: porcentaje de los callos transformados parcial o totalmente a las seis semanas, textura de los callos iniciales y porcentaje de los callos con señales organogénicas antes de pasar al medio de regeneración.

Los datos experimentales fueron procesados según el paquete estadístico Statgraphic plus versión 5 en ambiente Windows, mediante la prueba de Kruskal-Wallis (Kruskal y Wallis, 1952) para datos que no se ajustan a una distribución normal y la prueba de rangos mútiples de Student-Newman-Kewls (SNK).

Evaluación histológica de los callos

La evaluación histológica se realizó a los 28 y a los 35 días de cultivados los callos en medio de establecimiento (fig. 1), y después de una semana y 14 días de subcultivados en medio de regeneración.

Estos callos fueron fijados en formol al 10% durante tres períodos de tiempo: 24 horas, 72 horas y una semana, e incubados a 4ºC. Una vez retirado el formol se realizaron varios enjuagues con agua destilada durante 24 horas; los callos fueron introducidos en una bolsa de gasa y sumergidos en serie alcohólica ascendente con pases sucesivos cada 30 minutos, para lograr la deshidratación de los tejidos. Seguidamente se pasaron a una solución de isoamil-acetato para facilitar la inclusión en parafina y se realizaron tres pases (de 15, 30 y 30 minutos, respectivamente) en solución limpia.

La inclusión en parafina se hizo mediante tres pases sucesivos de 30 minutos cada uno en parafina líquida (Paraplast), mantenida a 60ºC en estufa. Después de los 30 minutos finales se colocó el fragmento de callo en parafina líquida limpia, la cual se encontraba en un molde cuadrado formado por placas de Leucart y planchas de aluminio. Se dejó enfriar el material a temperatura ambiente unos minutos y posteriormente se sumergió en agua helada para retirar las placas y recuperar el bloque de parafina.

Para realizar los cortes en micrótomo de parafina, los cubos fueron pegados a moldes en madera que se fijaron al equipo. Se realizaron cortes a una distancia de 10 mm y las tiras de parafina se deslizaron a una cubeta con agua a 37ºC, de donde se recogieron con portaobjetos de vidrio cubiertos por albúmina de Mayer. Las muestras, convenientemente identificadas, se incubaron por 24 horas en estufa a 37ºC.

Pasado este tiempo se sometieron a serie alcohólica ascendente para desparafinarlas y realizar el proceso de tinción, en el cual se utilizaron dos variantes: safranina-verde rápido y aceto carmín-azul de anilina.

Se comprobó la calidad de la tinción en vista previa al microscopio óptico trinocular (Nikon Ophiton) con aumento de 400X, y se procedió a montar los cortes con resina Entellán. Para cada explante se utilizaron 20 muestras, en las que se evaluaron aspectos metodológicos tales como: el tiempo óptimo de exposición en el fijador y la variante de tinción más adecuada para una mejor observación de los tejidos.

También se evaluaron aspectos biológicos del proceso regenerativo de los callos, como son: la existencia de conexión vascular entre las yemas y el resto del callo, y la formación de pared secundaria.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Después de 21 días de inoculados los explantes, en la variante control aún no manifestaban cambios apreciables en su superficie. Aproximadamente a los 30 días, se detectaron pequeñas masas de tejido indiferenciado en uno o en ambos extremos (por donde se realizaron los cortes en los Hi), las cuales no manifestaron un crecimiento o diferenciación apreciable. Por su parte, en los explantes HV y HC sólo ocurrió la formación de pequeñas raíces en la base de la hoja, por la zona de unión con el pecíolo.

Estos resultados pueden indicar la presencia de diferentes niveles de reguladores del crecimiento endógenos en los tres explantes. Según Beyl (1999), en ocasiones un tejido o explante es autotrófico y puede producir su propio suministro de reguladores del crecimiento. Las máximas concentraciones de auxinas se encuentran en los ápices en crecimiento, es decir, en la punta del coleóptilo, en las yemas y en los ápices en crecimiento de las hojas y de las raíces. Sin embargo, se encuentra también auxina ampliamente distribuida por toda la planta, procedente de las regiones meristemáticas. El hipócotilo es un órgano que, además de sostener la plántula, sirve de conexión entre las partes aéreas (hojas y ápices caulinares) y las raíces, y a través de él se traslocan los diferentes reguladores del crecimiento que se sintetizan en las partes de la planta antes mencionadas.

Al seccionar los Hi por debajo del ápice caulinar y por encima del cuello, las sustancias que se estaban transportando en uno u otro sentido (entre ellas auxinas y citoquininas) pudieron estimular la formación de callos en las zonas de los cortes. El hecho de haber perdido la conexión con los sitios de síntesis pudo provocar que las concentraciones de reguladores no fueran suficientes como para formar grandes masas de tejido indiferenciado en toda la superficie vegetal, por lo que la respuesta fue muy pobre.

Como señalara Beyl (1999), generalmente cuando existen bajas concentraciones de auxina, ya sea exógena o endógena, la formación de raíces puede verse favorecida; mientras que a mayores concentraciones se favorece la formación de callos.

Varios autores que han trabajado con otras especies del género Stylosanthes (Meijer, 1982; Dornelas et al., 1992; Consoli et al., 1996), con otras leguminosas (Vaquero, Roble y Ruiz; 1993) o con especies menos relacionadas (Fortes y Pais, 2000), han publicado resultados que indican que en ausencia de hormonas o en presencia solo de auxinas en el medio de cultivo, el crecimiento de callos es muy pobre o no ocurre.

En los restantes tratamientos en estudio, la formación de callos comenzó después de 15 días en cultivo. Al comparar el porcentaje de los callos que manifestaban una total o parcial desdiferenciación de sus tejidos internos, las diferencias significativas sólo se correspondieron con el factor explante (fig. 2).

Mientras los Hi se transformaban completamente en la mayoría de los tratamientos, las HV mantuvieron una zona alrededor de la nervadura central (incluyéndola a ella) que se desdiferenció muy poco, a excepción de las muestras cultivadas en el tratamiento seis, formado por las mayores concentraciones de 2,4-D (3 mg/L) y la de 6-BAP (4 mg/L). Por su parte, las HC mostraron un comportamiento intermedio con relación a los referidos anteriormente, pues en todos los tratamientos se encontraron callos de los dos tipos. En la literatura consultada sobre el cultivo in vitro en el género Stylosanthes no se hace referencia a esta característica, pero otros autores como Pierik (1990) han manifestado que, aunque un callo es en principio un tejido no organizado y poco diferenciado, se pueden encontrar tejidos sin desdiferenciar en agregados grandes de tejido calloso. Más recientemente Fortes y Pais (2000) observaron la formación de tejido calloso en segmentos internodales de Humulus lupulus a partir del parénquima cortical, mientras que por debajo de este se observaron células esclerenquimáticas que formaban una capa alrededor de los tejidos vasculares evitando la desdiferenciación de las zonas más internas del explante, lo cual pudiera haber sucedido en este caso aunque no fue comprobado.

Estas diferencias en cuanto al grado de desdiferenciación de los tejidos no influyeron marcadamente en los restantes eventos morfogenéticos; sin embargo, parecen haber incidido en la textura de los callos con relación al tipo de explante, como se puede apreciar en la tabla 2.

La mayoría de los callos formados en las HV mostraron una estructura compacta, aunque en algunos casos se detectaron callos con los bordes sueltos, y sólo en el tratamiento 5 (formado por la mayor concentración de auxina en una relación menor que uno con la citoquinina) se encontraron algunos callos completamente friables. En los otros dos explantes, aunque predominó la textura compacta, se apreciaron más callos con bordes libres y en algunos casos completamente friables, en un porcentaje mayor en Hi. Al relacionar estos resultados con las combinaciones hormonales aplicadas a los medios de cultivo, se pudo apreciar que mientras las variantes con menor concentración de 2,4-D (1 y 2) favorecieron la formación de callos compactos, al incrementarse la cantidad de hormona añadida al medio (variantes 3-6) apareció un mayor número de muestras con callos de bordes libres o completamente friables, con una mayor incidencia en aquellas donde la correlación auxina/citoquinina era igual o mayor que uno (3 y 5), lo que demuestra la influencia del 2,4-D en esta característica.

En general, para S. guianensis, varios autores coinciden en que cuando la auxina empleada es ANA se obtienen callos suaves (Mroginski y Kartha, 1981; Meijer, 1982) o friables (Meijer, 1982; Mesa et al., 1993), pero existen discrepancias en cuanto a la textura de los callos inducidos en presencia de 2,4-D. Mesa et al. (1993) obtuvieron callos compactos en todas las combinaciones de 2,4-D (1 y 2 mg/L) con 6-BAP (2 y 4 mg/L), lo cual no se corresponde totalmente con lo obtenido en este trabajo, ya que ellos no evaluaron la influencia de 3 mg de 2,4-D/L para la organogénesis de este cultivar. En otras especies del género, como Stylosanthes humilis (Meijer, 1982) y de otros géneros como Cen-trosema (Angeloni, Rey y Mroginski, 1992), los callos cultivados con bajas concentraciones de 2,4-D o de ANA en combinación con 6-BAP, tuvieron una textura compacta.

Aunque en estos resultados pudieran influir los criterios de evaluación de cada investigador, es oportuno recordar que la textura de los callos puede variar para diferentes especies por múltiples razones, entre las que se señalan: las concentraciones y combinaciones de los RCV utilizados (Pierik, 1990; Krikorian, 1995), las condiciones de incubación y los factores genéticos (Batista, Sousa y Pais, 1996), entre otras.

En cierta medida, la respuesta morfogenética de los callos también tuvo sus particularidades para cada explante (tabla 3), ya que se observó una interacción con el factor medio del cual procedían antes del subcultivo a medio de regeneración. Las mejores respuestas se lograron para los Hi en aquellas combinaciones de medios con menores concentraciones de 2,4-D (2 y 4), en las cuales la correlación auxina/citoquinina es menor que uno. En los restantes explantes, solamente se acercaron a esta cifra los callos procedentes de la variante uno.

Estos resultados difieren en algunos aspectos de los obtenidos por Mesa et al. (1993) para callos iniciales de este mismo cultivar. En su experiencia, los Hi fueron capaces de responder en todas las combinaciones hormonales, mientras que aquellos formados a partir de HC en medio uno no tuvieron respuesta, incluso después de dos subcultivos en medio de regeneración.

Otros autores, como Meijer (1982) y Godwin, Cameron y Gordon (1990), también detectaron diferencias en la capacidad morfogenética de callos provenientes de diferentes explantes, las cuales se acentuaron a medida que los callos envejecieron. En varias experiencias desarrolladas con otros cultivares, como S. guianensis cv. Cook (Meijer, 1982) y cv. CIAT-2243 (Miles, Roca y Tabares, 1990), los callos formados a partir de hipocótilos mantuvieron su capacidad morfogenética después de un año en cultivo, a diferencia de las hojas verdaderas que la perdieron a los seis meses.

De forma general, las variantes de medio de callo con más bajos niveles de 2,4-D (1 y 2 mg/L) en combinaciones con 2 y 4 mg de 6-BAP/L, favorecieron una mayor respuesta morfo-genética después del subcultivo a medio de regeneración donde se suprimió el 2,4-D, siempre que se mantuvo una correlación auxina/citoquinina menor que uno, como en los tratamientos 1 y 2 en el medio de establecimiento, y en algunos casos el 4. Varios autores, como Miles et al. (1990) y Mesa et al. (1993), han hecho referencia a dicha condición como indispensable para la organogénesis de este género; y otros como Consoli et al. (1996) y Valarini, Otsuk y Vieira (1997), aunque no lo han referido, han utilizado combinaciones hormonales con la misma correlación.

Evaluación histológica de los callos

De los tres tiempos utilizados para la fijación, los mejores resultados se obtuvieron cuando el material se mantenía más de 72 horas en formol al 10%, fundamentalmente en los callos provenientes de Hi, los cuales en su mayoría eran más sueltos y suaves. Cuando se emplea un tiempo menor que 72 horas, aunque se obtienen cortes para observar al microscopio, en muchos casos hay rotura de células o pérdidas de una parte del tejido.

Varios autores (Dornelas et al., 1992; Trigiano, Malueg y Graham, 1999; Fortes y Pais, 2000) coinciden al utilizar un tiempo de fijación similar para estudios histológicos, ya sea de especies del mismo género o no, o para diferentes soluciones fijadoras. En cuanto a las variantes de tinción, la combinación safranina-verde rápido permitió obtener un mejor contraste entre la pared celular y el citoplasma de las células, así Dornelas et al. (1992) también utilizaron tinción con safranina, pero combinada con azul astra, en un estudio histológico de la organogé-nesis y la embriogénesis en S. scabra, la cual le permitió realizar una caracterización histológica, así como determinar la relación directa entre la hormona y la respuesta del tejido. Esta variante ha sido utilizada de forma exitosa en otras leguminosas como Phaseolus coccineus L. (Vaquero et al., 1993).

Por otra parte, como puede observarse en la figura 3, la formación del cono meristemático con los primordios foliares es apreciable en cortes efectuados a los callos a los 25 días en medio de inducción. Es conveniente recordar que estos callos tienen la peculiaridad de haberse formado en un medio donde la relación auxina/citoquinina fue menor que uno. Según plantearon Pierik (1990) y Krikorian (1995), la formación de vástagos puede producirse sobre el callo si existe una baja concentración de auxina (aunque este no es exactamente el caso) y una alta concentración de citoquinina, y la 6-BAP es la más eficaz. Por otra parte, ellos señalaron que la formación de vástagos sobre el callo posiblemente esté influida por factores mucho más complejos que los que hasta ahora se conocen, tales como: la concentración de sales del medio de cultivo y las condiciones de iluminación.

Al analizar la estructura histológica de estos callos se observó una región periférica constituida por células con características similares a las hiperhídricas descritas por Gautheret (citado por Dornelas et al., 1992). En algunos sectores del callo por debajo de estas células se encontraron zonas con células de citoplasma muy denso con características meristemáticas. El resto del callo estaba compuesto por células parenquimatosas organizadas de forma compacta en algunas áreas y en otras de forma menos organizada.

También se pudieron apreciar zonas de tejido meristemático organizado en forma de bandas desde el cono meristemático hacia el interior del callo (fig. 3 B), que sugieren la formación de procambium a partir del cual se formarán los futuros tejidos vasculares. Dornelas et al. (1992) describieron la presencia de nódulos vasculares en el interior del callo, en los cuales posteriormente se desarrollaron el xilema y el floema, que mantuvieron la misma orientación que en el tallo de una planta. Por su parte, Fortes y Pais (2000) describieron la formación de tejido vascular a partir de divisiones tangenciales que sufrieron determinadas células corticales de los segmentos internodales utilizados como explantes; este sería el precursor de los llamados nódulos organogénicos descritos anteriormente por otros autores (Warrag, Lesney y Rockwood, 1991; Teng, 1997).

Sin embargo, en los cortes realizados a los 35 días (fig. 4 A) en algunos callos inducidos en las variantes de mayores concentraciones de 2,4-D (3 mg/L), los cuales desarrollaron una estructura con bordes sueltos o friables, se detectaron estructuras sin aparente conexión histológica con el resto del callo y con acumulación de células meristemáticas en su borde interno.

Según Schwarz y Beaty (1999), además de la naturaleza del explante utilizado, el tipo de hormona y su concentración también pueden influir en el proceso morfogenético que ocurra; el 2,4-D es la más utilizada y efectiva cuando se desea un callo embriogénico. En este sentido, Dornelas et al. (1992) obtuvieron callos embriogénicos a partir de cotiledones de S. scabra cultivados en presencia de esta hormona, en concentraciones superiores a los 3 mg/L.

En los restantes cortes histológicos realizados (fig. 4 B) en callos sometidos a la influencia del medio de regeneración, la rediferenciación de los tejidos en brotes foliares fue mucho más evidente y masiva, lo cual pudo ser observado incluso a simple vista. Se apreciaron zonas dispersas de agrupaciones de tejido meristemático por el interior del callo, lo cual puede indicar un fuerte estímulo a la división celular y a las transformaciones morfogenéticas por el medio de cultivo, aunque como fue analizado anteriormente no ocurrió de igual manera para todos las callos, atendiendo al medio de inducción de callogénesis precedente. De forma general, la formación de yemas adventicias ocurrió a partir de procesos de desdiferenciación y rediferenciación del tejido del explante, y se mantuvo determinada comunicación entre las células del callo y las de los brotes foliares, lo cual indica una regeneración organogénica por vía indirecta, como fue descrita para S. scabra por Dornelas et al. (1992) y Valarini et al. (1997).

La aparición de estructuras de origen no precisado y la posibilidad de ocurrencia de otros procesos citológicos durante la desdiferenciación y la rediferenciación de los tejidos, sugiere la posibilidad de diseñar nuevos estudios donde se empleen intervalos de tiempo menores y que abarquen un período mayor de respuesta de los explantes y callos, así como otras evaluaciones de carácter genético o molecular.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Angeloni, P.N.; Rey, H.Y. & Mroginski, L.A. Regeneration of plants from callus tissue of the pasture legume Centrosema brasilianum. Plant Cell Reports. 1992. 11:519

2. Batista, D.L.; Sousa, M.J. & Pais, M.S. Plant regeneration from stem and petiolederived callus of Humulus lupulus L. (Hop) clone Bragança and var. Brewer's Gold. In Vitro Cell Developmental Biology. 1996. 32:37

3. Beyl, Caula A. Getting started with tissue culture media preparation, steril technique and laboratory equipment. In: Plant tissue culture. Concepts and laboratory exercises. (Eds. R.N. Trigiano & D.J. Grey). ^nd ed. CRC Press LLC, USA. 1999.

4. Consoli, L.; Vieira, M.L.C.; Lopes de Souza, C. Jr. & Garcia, A.A.F. 1996. Tissue culture effects on quantitative traits in Stylosanthes guianensis (Leguminosae). Brazilian Journal of Genetics. 19:469

5. Dornelas, M.C.; Vieira, M.L.C. & Appezatto da Gloria, B. 1992. Histological analysis of organogenesis and somatic embryogenesis induced in inmature tissues of Stylosanthes scabra. Annals of Botany. 70:477

6. Fortes, A.M. & Pais, M.S. 2000. Organogenesis from internode-derived nodules of
Humulus lupulus var. Nugget (Cannabinaceae): histological studies and changes in the starch content. American Journal of Botany. 87:971

7. Gamborg, O.L.; Miller, R.A. & Ojima, K. 1968. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50:151

8. Godwin, I.D.; Cameron, D.F. & Gordon, G.H. 1990. Variation among somaclonal progenies from three species of Stylosanthes. Aust. J. Agric. Res. 41:645

9. Keoboualapheth, Ch. & Mikled, Ch. 2003. Growth performance of indegenous pigs fed with Stylosanthes guianensis CIAT-184 as replacement for rice bran. Livestock Research for Rural Development. 15:9

10. Krikorian, A.D. 1995. Hormones in tissue culture and micropropagation. In: Plant hormones. Physiology, biochemistry and molecular biology. (Ed. P.J. Davies). Kluwer Academic Publishers, Netherlands. p. 774

11. Kruskal, W.H. & Wallis, W.A. 1952. Use of ranks in one criterion analysis of variance. J. Amer. Statis. Assoc. 47:583

12. Lovato, M.B. & Martins, P.S. 1997. Genetic variability in salt tolerance during germination of Stylosanthes humilis H.B.K. and association between salt tolerance and isozimes. Brazilian Journal of Genetics. 20:435

13. Meijer, E.G.M. 1982. Shoot formation in tissue cultures of three cultivars of the tropical pasture legume Stylosanthes guianensis (Aubl.) Sw. Z. Pflanzenzuchtg. 89:169

14. Mesa, A.R.; Lajonchere, G.; Prieto, M. & Toral, Odalys. 1993. Organogénesis en Stylosanthes guianensis cv. CIAT 184. Pastos y Forrajes. 16:207

15. Miles, J.W.; Roca, W.M. & Tabares, E. 1990. Assesment of somaclonal variation in Stylosanthes guyanensis (Aubl.) Sw., a tropical forage legume. In: Application of tissue culture in agriculture. (Eds. W.M. Roca & J.W. Miles). Centro Internacional de Agricultura Tropical. Cali, Colombia. p. 249

16. Mroginski, L.A. & Kartha, K.K. 1981. Regenerations of plants from callus tissue of the forage legume Stylosanthes guianensis. Plant Science Letters. 23:245

17. Murashige, T. & Skoog, F. 1962. A revised medium for rapid growth and biossays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plantarum. 15:473

18. Pierik, R.L. 1990. Cultivo in vitro de las plantas superiores. Ediciones Mundi-Prensa. Madrid, España

19. Quecini, Vera M. & Vieira, Maria L.C. 2001. Transient gene expresion in electroporated intact tissues of Stylosanthes guianensis (Aubl.) Sw. Scientia Agricola. 58:759

20. Schwarz, O.J. & Beaty, R.M. 1999. Plant tissue culture. Concepts and laboratory exercises. (Eds. R.N. Trigiano & D.J. Grey). 2^nd ed. CRC Press LLC, USA

21. Sutherst, R.W.; Wilson, L.J.; Reid, R. & Kerr, J.D. 1998. A sourvey of the ability of tropical legumes in the genus Stylosanthes to trap larvae of the cattle tick, Boophilus microplus. Aust. J. Exp. Agric. 28:473

22. Teng, W.L. 1997. An alternative propagation method of Ananas through nodule culture. Plant Cell Reports. 16:454

23. Trigiano, R.N.; Malueg, Kathleen & Graham, E.T. 1999. Histological techniques. In: Plant tissue culture Concepts and laboratory exercises. (Eds. R.N. Trigiano & D.J. Grey). 2^nd ed. CRC Press LLC, USA. p. 3

24. Valarini, M.J.; Otsuk, I.P. & Vieira, M.L.C. 1997. Changes in N₂ fixation in Stylosanthes scabra derived from tissue culture. Brazilian Journal of Genetics. 20 (4):713

25. Vaquero, Francisca; Robles, C. & Ruíz, María L. 1993. A method for long-term micropropagation of Phaseolus coccineus L. Plant Cell Reports. 12:395

26. Warrag, E.; Lesney, M.S. & Rockwood, D.J. Nodule culture and regeneration of Eucalyptus grandis hybrids. Plant Cell Reports. 1991. 9:586

Recibido el 3 de mayo del 2004
Aceptado el 10 de junio del 2005