ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN
ºACETOBACTER DIAZOTROPHICUS, UNA ENDOFITA FIJADORA DE NITROGENO
Isora González
Estación Experimental de Pastos y Forrajes "Indio Hatuey" Matanzas, Cuba
INTRODUCCIÓN
El nitrógeno
es un elemento necesario en la composición de las proteínas, los
ácidos nucleicos y otros componentes celulares, además de ser
el responsable de la elevación de los rendimientos en los cultivos, cuestión
de suma importancia en los países en desarrollo donde se ve afectada
dicha producción por la carencia de este elemento.
En la actualidad
se requieren aproximadamente 18,5 Mcal de energía fósil para la
producción de un kilogramo de fertilizante nitrogenado, lo cual traerá
como consecuencia que en las próximas décadas sea inevitable que
el precio del combustible fósil ascienda, a causa del agotamiento de
las reservas y el incremento del costo de producción de otros combustibles.
Por tal razón,
este es el momento de crear alternativas estratégicas para el suministro
del nitrógeno, con lo cual se evita el agotamiento de las reservas naturales
y la contaminación ambiental.
Diversas bacterias
fijadoras de nitrógeno han sido encontradas en asociación con
cereales y pastos (Dobereiner, 1988). Estudios recientes realizados mediante
el balance de N y el empleo de diluciones isotópicas N15,
han confirmado que ciertas variedades de caña de azúcar son capaces
de obtener grandes contribuciones de N como producto de la fijación biológica
del nitrógeno (Urquiaga, Cruz y Boddey, 1992).
Dentro de estos
microorganismos fijadores de nitrógeno se encuentra Acetobacter diazotrophicus,
la cual ha sido aislada en caña de azúcar (Cavalcante y Dobereiner,
1988) y otros cultivos en diferentes zonas geográficas; se ha señalado
además su importancia económica, comparada con la de otras diazotrofas
aisladas.
En esta reseña
se brindan sus características fundamentales, así como el efecto
que ejerce en la caña de azúcar y su interacción con otros
microorganismos.
Características
del género
El género
Acetobacter (bacteria del ácido acético) se caracteriza, según
Beijerinck, por presentar desde células elipsoidales hasta formas bacilares
rectas o ligeramente curvadas; su tamaño es de 0,6-0,8 x 1,0-4,0 mm.
Su forma de involución más frecuente puede ser esférica,
elongada, curvada, filamentosa, etc.
Son mótiles
o no mótiles; si son mótiles, la inserción es perítrico
o lateral, no forman endosporas. Son aerobias obligadas y poseen un metabolismo
respiratorio que no es fermentativo (De Ley, Swings y Gosselé, 1984).
Son catalasa positiva,
oxidasa negativa y crecen bien en sales de ácidos orgánicos tales
como el acetato y el lactato, los cuales son oxidados hasta dióxido de
carbono y agua.
Las mejores fuentes
de carbono son el etanol, el glicerol y el lactato. Oxidan el etanol hasta ácido
acético; el ácido es formado desde n-propanol, n-butanol y D-glucosa.
Estas bacterias son marcadamente acidófilas, crecen a pH tan bajos como
4, con un crecimiento óptimo entre 5 y 6. Su temperatura óptima
de crecimiento oscila entre 25 y 30 °C. El por ciento molecular de G+C
del DNA es aproximadamente 51-65 % (De Ley et al., 1984)
Las bacterias del
ácido acético poseen un metabolismo oxidativo y una serie de características
poco usuales con respecto a los restantes géneros (Stainer, Adelberg
e Ingraham, 1985).
Estos autores han
planteado que los azúcares son oxidados hasta dióxido de carbono
exclusivamente a través de la ruta de las pentosas fosfato; la ruta de
Entner-Doudoroff, común en el resto de los quimioheterótrofos
aerobios, no actúa en este grupo. El metabolismo del piruvato es también
raro. Mientras en muchos aerobios el piruvato es oxidado a acetil-CoA y dióxido
de carbono, las bacterias del ácido acético lo descarboxilan de
un modo no oxidativo a acetaldehído.
Puesto que este
es también el primer intermediario en la desasimilación del etanol,
se sitúa en un punto de convergencia metabólica entre la oxidación
del sustrato metabolizada a través del piruvato y la oxidación
del etanol (fig.1).
Además de la ruta de oxidación de las pentosas fosfato, estas pueden oxidar la glucosa a través de una segunda ruta no fosforilativa, la cual da lugar a un cúmulo de productos oxidados parcialmente, que suelen ser el gluconato y los cetoácidos derivados de él (fig.1).
Además de oxidar los alcoholes primarios con acumulación de los ácidos carboxílicos (por ejemplo, la oxidación del etanol a ácido acético), pueden oxidar muchos alcoholes secundarios a cetonas. Algunas de las oxidaciones de los alcoholes primarios y secundarios se indican en la tabla 1.
De Ley, Swings
y Gosselé (1984) clasificaron 4 especies de este género: Acetobacter
aceti, A. liquefaciens, A. pasteurianus y A. hansenii.
Acetobacter está
presente en las flores, los frutos, la miel de abeja, la cidra, la cerveza,
el jugo de la caña, etc.
El etanol es usado
como fuente de carbono y oxidado hasta dióxido de carbono y agua.
Poseen un metabolismo
respiratorio con el oxígeno como aceptor final de electrones. Bajo 0,2
Kpa de O2 en la atmósfera, muestran una concentración
de oxígeno disuelto óptima para la reducción de acetileno
y continúan fijando el dinitrógeno atmosférico hasta 4,0
Kpa (Reis, Zang y Burris, 1990).
El crecimiento
de esta bacteria ocurre a altas concentraciones de glucosa y sacarosa y los
valores oscilan entre 10 (Boddey et al., 1994) y 30 % (Cavalcante y Dobereiner,
1988); no crece a pH=7 (Cavalcante y Dobereiner, 1988). Stephan, Oliveira, Teixeira,
Martínez-Drets y Dobereiner (1991) obtuvieron un crecimiento y fijación
del dinitrógeno atmosférico (más de 100 n moles C2H2.
m1-1.h-1) a pH 3 o menos. Su pH óptimo de crecimiento
es 5,5 y su temperatura óptima 30°C.
Se forman colonias
carmelita oscuro en agar papa con 10 % de sacarosa y naranja oscuro en medio
agar mineral pobre en N (0,005 % N extracto levadura) con 10 % de sacarosa y
bromotimol azul (Cavalcante y Dobereiner, 1988; Dobereiner, 1988; Boddey et
al., 1994).
A. diazotrophicus
no posee la enzima nitrato reductasa y es capaz de fijar N2 en presencia
de altas concentraciones de nitrato (10 mM) (Caval-cante y Dobereiner, 1988)
que pueden llegar hasta 25 mM (Boddey et al., 1994). Además, el NH4
causa inhibición parcial de la enzima nitrogenasa (Boddey, Urquiaga,
Reis y Dobereiner, 1991).
Otro aspecto interesante
es que se ha sugerido la producción de ácido indol acético
por esta bacteria, favoreciendo el enraizamiento y el crecimiento de la caña
de azúcar por los efectos directos sobre los procesos metabólicos
(Cavalcante y Dobereiner, 1988; Boddey et al., 1991; Fuentes-Ramírez,
Jiménez-Salgado, Abarca-Ocampo y Caballero-Mellado, 1993) y la producción
de citocianinas (Jiménez-Salgado, Aparicio-Fabré y Caballero-Mellado,
1994) en adición al papel de la fijación biológica del
N (FBN).
Estudios genéticos
realizados en diferentes regiones geográficas de Brasil y México
en caña de azúcar, mostraron una diversidad genética limitada
y se sugiere que esta pudiera estar relacionada con el habitat de A. diazotrophicus,
además de indicar que su estructura genética es clonal y que los
genes nif se encuentran localizados sobre el cromosoma (Caballero-Mellado y
Martínez-Romero, 1994).
Habitat
A. diazotrophicus
es considerada una bacteria endófita (Dobereiner, Pimentel, Olivares
y Urquiaga, 1990); esta ha sido aislada en diferentes variedades de caña
de azúcar en Brasil (Cavalcante y Dobereiner, 1988), Australia (Li y
MacRae, 1992) y México (Fuentes-Ramírez et al., 1993), en el interior
de la raíces, los tallos (parte basal y apical), las hojas y las pajas
en un rango de 103 hasta 107 (Dobereiner et al., 1988).
Hasta el momento
no ha sido encontrada en el suelo o en las plantas fuera de cultivo en los surcos
de caña de azúcar, ni en los granos de sorgo (Boddey et al., 1994).
Además se
informa la presencia de esta bacteria en Pennisetum purpureum cv. Camerum, en
boniato (Ipomoea batata) (Paula, Reis y Dobereiner, 1991; Li y MacRae, 1991;
1992) y en king grass en Cuba (García-Gómez, Pérez-Pérez,
Cruz y Martínez, 1994).
La alta especificidad
de A. diazotrophicus fue demostrada sobre la base de las observaciones; solo
se ha encontrado en plantas propagadas vegetativamente y con altas concentraciones
de azúcares (Dobereiner et al., 1988), pero no en plantas cultivadas
por semilla (Reis, citado por Paula et al., 1991).
Efectos de la
inoculación con A. diazotrophicus
Los estudios realizados
con la mezcla de cultivos de A. diazotrophicus y una levadura amilolítica
(Lypomyces kononenkoae), usada como sistema modelo para la interacción
planta-bacteria, demostraron que la mitad del nitrógeno fijado puede
ser transferido a la levadura, lo cual sugiere que la bacteria pudiera excretar
activamente la mitad del N fijado en forma disponible para la planta (Cojho,
Reis, Schenberg y Dobereiner, 1993) (fig.2).
Los trabajos de
inoculación realizados en caña de azúcar micropropagada
mostraron que no fue infestada por A. diazotrophicus al utilizar el método
de la inoculación tradicional a través de la raíz. Sin
embargo, "in vitro"en medio rico en azúcar se halló
la presencia de A. diazotrophicus en el tejido interno y externo de la planta
a través de marcadores inmunológicos y técnicas de microscopía
óptica y electrónica (James, Reis, Olivares, Baldani y Dobereiner,
1994).
Además,
sobre la raíz la bacteria fue hallada particularmente en las cavidades
de las uniones laterales y los extremos, que se mostraron como evidentes sitios
de preferencia para su entrada; en estos lugares fue observada aparentemente
intacta, con células epidérmicas alargadas.
James et al. (1994)
mostraron que en el tallo la bacteria se encontró principalmente en su
base y dentro de este en los vasos xilemáticos, a través de los
cuales la misma migra por el flujo de transpiración y el tejido foliar
es infestado; se sugiere que los vasos xilemáticos en el área
foliar de las plantas maduras son un posible sitio de fijación del dinitrógeno
atmosférico por diazótrofas y que proporcionan bajo pO2 y energía para la actividad de la nitrogenasa.
La infección
de A. diazotrophicus se dificulta en las plantas cultivadas en suelos o en vermiculita
y puede ser superada por la co inoculación con hongos de MA. En este
sentido, Paula et al. (1991) estudiaron el papel de las esporas de MA en la
infección del boniato (Ipomoea batata), la caña de azúcar
(Saccharum spp.) y el sorgo azucarero (Sorghum vulgare) por A. diazotrophicus
y la interacción entre estos dos endófitos.
Los resultados
demostraron que las esporas de Glomus clarum que contenían A. diazotrophicus
proporcionaron incrementos adicionales en el número de esporas formadas
dentro de la raíz en boniato. A. diazotrophicus infestó la parte
aérea de la planta solamente cuando fue inoculada con MA + A. diazotrophicus
o cuando estaba presente en el interior de las esporas de MA. Los mayores efectos
fueron observados con la inoculación de esporas que contenían
la bacteria (tabla 2).
Un efecto similar fue obtenido en caña de azúcar micropropagada "in vitro"y cultivada en suelo no estéril (tabla 3); mientras que el efecto de A. diazotrophicus sobre la colonización de MA y sobre el número de esporas dentro de la raíz fue también observado en sorgo azucarero, con la excepción de que la parte aérea no fue colonizada por A. diazotrophicus (tabla 4).
La filosofía
del beneficio de los diazotrofos con MA no ha sido entendida, aún cuando
se han observado efectos similares con bacterias rizoféricas en varias
especies de plantas (Barea, Bonis y Olivares, 1983; Rao, Tilak y Singh, 1985;
Pacovsky, Fuller y Paul, 1985; Will y Sylvia, 1990). Según Mosse (1962),
las modificaciones cuantitativa y cualitativa en la actividad enzimática
en la interfase raíz-simbionte o en las hormonas juegan el papel esencial;
otra explicación a este fenómeno pudiera ser la competencia por
los fotosintatos, que estimulan la proliferación de los microorganismos
(Paula et al., 1991).
La posibilidad
de introducir microorganismos diazotrofos en el interior de las raíces
de las plantas por esporas de MA, representa una única posibilidad de
introducción seleccionada o genética mejorada (Dobereiner, 1992);
además, no solo ayuda al rápido crecimiento de la planta, sino
que garantiza su resistencia a las enfermedades, por lo que cada vez es más
eficiente el proceso de FBN en la misma.
Cambios recientes
en el concepto de la interacción planta-bacteria
La ocurrencia de
diazotrofos como A. diazotrophicus aislada en el interior de las raíces
y el tallo de la caña de azúcar (Cavalcante y Dobereiner, 1988),
considerada de naturaleza endófita (Dobereiner et al., 1990), marca una
diferencia notable con el clásico concepto de las asociaciones rizoféricas,
en que solamente una pequeña porción de los exudados radiculares
están disponibles para la bacteria; mientras que las bacterias endófitas
pudieran recibir beneficios superiores. Si se considera eficaz la cantidad de
10 mg de N2 fijado/g de azúcar, el 30 % del total de azúcar
producida pudiera ser usada para la fijación de 200 kg de N2/ha.
Como es conocido, las plantas con ciclo fotosintético C4,
como la caña de azúcar o el sorgo, usan menos del 50 % de su
capacidad fotosintética, por lo que pudieran proporcionar el 30 % de
los nutrimentos a las diazotrofas (Dobereiner, 1992).
En adición,
esta nueva diazotrofa posee características diferenciales que no son
encontradas en las clásicas asociaciones rizoféricas. El amonio,
aun en altos niveles (10 mM), solamente inhibe parcialmente la actividad de
la nitrogenasa (Reis et al., 1990); las altas concentraciones de azúcar,
como ocurre en los tallos de la caña de azúcar, ayudan a reducir
la asimilación del amonio (Boddey et al., 1991) y el efecto de inoculación
señalado en el acápite anterior.
CONCLUSIONES
Una nueva bacteria
fijadora de nitrógeno, A. diazotrophicus, fue hallada en el interior
de las raíces y los tallos de la caña de azúcar en algunas
regiones de Brasil, México, Australia y Cuba; esta aparece además
en plantas ricas en azúcar y que se propagan vegetativamente, como el
P. purpureum cv. Camerum, el boniato y el king grass.
Esta bacteria se
caracteriza por fijar el dinitrógeno atmosférico cuando existen
altas concentraciones de sacarosa (10-30 %) y a pH extremadamente ácido;
dicha fijación no es afectada por las altas concentraciones de nitrato
(10-25 mM) y el amonio solo causa inhibición parcial de la enzima nitrogenasa;
además, posee la capacidad de producir sustancias estimuladoras del crecimiento
vegetal.
Dichas características,
en adición a su naturaleza endófita, han provocado recientes cambios
en el concepto de la interacción planta-bacteria.
La interacción
de este microorganismo con los MA muestra la posibilidad de su co-inoculación.
Los resultados
expuestos en esta reseña abren la posibilidad del estudio y la selección
de cepas de A. diazotrophicus bajo diferentes condiciones en Cuba, con el fin
de explotar su potencial nitrofijador y estimulador del crecimiento vegetal.
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