ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN

 

 

 

El cultivo In Vitro en el mejoramiento de pastos y forrajes. I. Variación somaclonal.

 

 

 

A.R. Mesa, G. Lajonchere y Odalys Toral
Estación Experimental de Pastos y Forrajes "Indio Hatuey" Matanzas, Cuba

 

 

 


 

 

INTRODUCCIÓN

La ganadería tradicional cubana se basó en el empleo de los pastos, constituidos principalmente por especies de gramíneas endémicas y naturalizadas, generalmente de poco valor nutritivo y productividad, explotadas a través de un sistema de manejo extensivo.

Al triunfo de la Revolución la producción de carne y leche constituyó la piedra angular para el necesario desarrollo de la base alimentaria de la población, por lo que fue necesario el incremento cuantitativo y cualitativo de la masa ganadera disponible, para la cual los pastos constituyen el alimento fundamental en un sistema de bajos insumos. Por ello, resulta necesario la búsqueda de nuevas variedades de pastos más productivos a través del mejoramiento genético y de la biotecnología.

El mejoramiento genético persigue reestructurar en un individuo todos los caracteres de interés para el productor. En los pastos y forrajes es de gran importancia mejorar cada vez más los indicadores de producción de materia seca, porcentaje de proteína bruta, fibra bruta y de hojas, así como la producción de semillas de calidad y la resistencia a plagas y enfermedades. Con estos objetivos el mejorador va en busca, finalmente, de un alimento de buena calidad, con repercusión en la producción de leche y carne.

Uno de los grandes problemas que han presentado los programas de mejoramiento en la mayoría de los partos, consiste en el modo de reproducción asexual, fundamentalmente la apomixis, como ocurre en Cynodon, Panicum, Cenchrus y otras. Los trabajos de Combes y Pernés (1972) y Chaume y Savidán (1977), entre otros, han abierto nuevos horizontes al mejoramiento genético en estas especies.

En sentido general, cualquier programa convencional de mejoramiento se caracteriza por ser relativamente demorado en lograr su objetivo final. Es por ello, y por otros inconvenientes, que resulta necesario la búsqueda de nuevas vías más rápidas y seguras.

Con la explosión del desarrollo de la ciencia y la técnica, surge un nuevo mundo, la Biotecnología, que va invadiendo todas las disciplinas y campos que domina el hombre harta estos momentos.

Los avances en la biología molecular y en el metabolismo genético y bacterial han contribuido al desarrollo de la biotecnología (Sasson, 1989), la cual, como en otros muchos casos, puede ser aplicada para mejorar genéticamente los pastos en Cuba.

En este artículo se analizará el papel de la variación somaclonal en el mejoramiento genético, así como los factores que la afectan.

 

Importancia del cultivo in vitro

La biotecnología, según Sasson (1989), es "la aplicación de principios científicos e ingenieriles para el procesamiento de materiales por agentes biológicos y así obtener beneficios y servicios". Estos agentes biológicos a que se refiere el autor son los microorganismos, animales, plantas, enzimas y células y la definición abarca desde el cultivo de tejido hasta la ingeniería genética.

En el mundo actual, las aplicaciones de la biotecnología abordan todas las ramas de los métodos convencionales de mejora y producción de semillas. Las fundamentales son: mejoramiento genético, propagación masiva, conservación de germoplasma y producción de metabolitos secundarios.

En el mejoramiento genético se pueden considerar tres campos de aplicación:

Técnicas auxiliares del mejoramiento genético. Tienen como objetivo hacer más eficientes los métodos convencionales de cruzamiento, como son: el rescate de embriones (Torrey, 1973; Pérez Padrón y González Rivero, 1991), el cultivo de anteras (Bajaj, 1983), los mapas genéticos y los marcadores moleculares para la selección. Estas técnicas no han sido aplicadas en pastos tropicales.

Mejoras por mutación somaclonal o inducidas. En este campo, la variabilidad genética para cualquier programa de mejora vegetal que se produce in vitro es muy importante y se han obtenido resultados relevantes en varios cultivos forrajeros, tales como Panicum maximum (Bajaj, Sidhu y Dubey, 1981; Lu, Vasil y Vasil, 1981; Karlsson y Vasil, 1986), Stylosanthes guianensis (Mroginski y Kartha, 1981; Szabados y Roca, 1986) y Digitaria eriantha (Watt, Mycock y Cresswell, 1989).

Transformaciones genéticas de las plantas. En este caso, según Pérez-Ponce y Jiménez (1992), la variabilidad genética es creada por los genes aislados o semiutilizados por la biología molecular e incorporada a las plantas por ingeniería genética, aunque las técnicas biotecnológicas sustentan el manejo del material biológico in vitro y la posterior regeneración de las plantas.

Por todo lo anteriormente expuesto, reviste gran importancia el conocimiento y la utilización de dichas técnicas en el mejoramiento genético de cualquier especie vegetal. No obstante, por su extensión solamente se expondrá lo relacionado con la variación somaclonal.

Por otra parte, a nivel internacional son muy pocos los estudios biotecnológicos en los pastos tropicales con relación a otros cultivos de interés agrícola; estos se concentran en las siguientes especies: Digitaria decumbens (Cheng, 1985); Pennisetum purpureum (Wang y Vasil, 1983; Chandler y Vasil, 1984), Sorghum bicolor (Brettell, Wernicke y Thomas, 1980); Leucaena leucocephala (Nagmani y Venketeswaram, 1983) y Cynodon dactylon (Ahn, Huang y King, 1985; Artunduaga, Taliaferro y Johnson, 1988). Por ello, estos estudios son altamente importantes, máxime cuando la variabilidad genética esté muy restringida o cuando sean limitadas las prospecciones en los centros de origen de las especies forrajeras

 

Variación somaclonal

En la técnica de micropropagación, comúnmente usada por los biotecnólogos, se observaron en ocasiones cambios fonológicos del material vegetal multiplicado. En un principio se desconocieron sus causas, pero ello constituyó una limitante para cumplir los objetivos de la micropropagación. Larkin y Scowcroft (1981) desarrollaron un minucioso estudio de esta variabilidad y la definieron por primera vez. Posteriormente dichos autores profundizaron en esta nueva opción para el mejoramiento genético (Scowcroft y Larkin, 1982) y algunos años después Larkin (1987) generalizó su definición.

Según Vasil (1986), la variabilidad obtenida por cultivo in vitro, se debe a los cambios que ocurren durante el período de crecimiento del callo, los cuales pueden ser genéticos o no genéticos. El autor argumenta que algunos de estos cambios son derivados de las células aberrantes que preexistían en el explante o de los disturbios fisiológicos causados por el ambiente de cultivo. Tales variaciones son motivadas por disturbios en los niveles de expresión de los genes, más que por cambios inducidos durante el cultivo en las plantas regeneradas.

Se puede plantear, por tanto, que la variabilidad por cultivo in vitro está controlada genéticamente y se denomina variación somaclonal.

Se plantea que las plantas regeneradas de tejidos meristemáticos organizados, tales como ápices vegetativos o yemas axilares, son visualmente estables en tipo y uniformidad y ocasionalmente producen variantes epigénicas o mutantes somáticas. Sin embargo, la fase de callo que precede a la diferenciación a veces ocasiona variación genética entre las plantas regeneradas. Esta variación somaclonal es reconocida ahora como un fenómeno general que ocurre en los tejidos de los callos desdiferenciados y no organizados, y los cambios genéticos pueden ocurrir más fácilmente en la fase de callo (Anon, 1986a). Se ha demostrado en múltiples cultivos que dichos cambios persisten a través de la diferenciación y regeneración de las plantas.

La variabilidad por la vía de la ortogénesis puede ser inducida por el tipo de explante utilizado, por la acción mutagénica del medio de cultivo empleado para la formación del callo o por la combinación de ambas.

En caña de azúcar, Liu (1981) encontró variabilidad para caracteres morfológicos; resultados similares han sido obtenidos en Cuba por otros investigadores. González (1988a), en un estudio realizado con la variedad Ja 64-19, obtuvo gran variabilidad en la mayoría de los componentes del rendimiento para la población somaclonal; González (1988b) comprobó que la población de plantines fue más fina, menos alta y de menor rendimiento que la población de la variedad donadora; también la variabilidad de los componentes del rendimiento no fue incrementada significativamente en su población somaclonal, pero sus individuos presentaron un mayor rango de variación, lo que posibilitó la selección de genotipos con rendimientos superiores a los del donante. Se ha informado además, mediante esta técnica, genotipos resistentes a estrés de suelo (Pérez, Milanés, Cabrera y Morales, 1984) y otros con supresión en la floración (Pérez Ponce, 1988), por lo que se puede plantear, de acuerdo con estos resultados analizados, que la variación que se produce por cultivo de tejidos es suficiente para la selección.

Por otra parte, Meijer (1984) describió anormalidades en plantas regeneradas en Stylosanthes guianensis por cultivo in vitro en cuanto al tamaño y la forma de las hojas, el grosor del tallo, la longitud de los internodos y la ausencia de dominancia apical, y aunque la variabilidad persistió en las plantas propagadas clonalmente, la naturaleza genética de estos cambios morfológicos aun no ha sido confirmada.

También en el CIAT Tabares, Pineda, López, Szabados y Roca (1986) determinaron la extensión de la variabilidad en plantas de esta especie regeneradas in vitro. En 96 plantas obtenidas por callos, derivadas de hojas e hípocótilos, encontraron caracteres muy similares a los señalados anteriormente y el 20% de estas plantas fueron tetraploides (2n = 40)

En Cuba Saura, Martínez, Prieto y Santana (1987) regeneraron plantar de P. maximum Jacq. a partir de tejido meristemático apical en el medio Murashige y Skoog suplementado con 3 mg/l de 2,4-D +10% de harina de coco; cuando se subcultivaron estos callos con 0,3 mg/l de Kinetina, obtuvieron plantas que mostraron una marcada variabilidad genética. Ello fue comprobado por Pereira, Prieto y Ávila (1990) al utilizar un método electroforético con dos sistemas enzimáticos (esterasas y peroxidasas), quienes observaron diferencias entre los calloclones.

Crougham y Hebert (1988) utilizaron el método de cultivo in vitro para la ampliación del germoplasma de Cynodon dactylon y demostraron que las plantas regeneradas tuvieron una variación útil, ya que hubo somaclones con una mayor tasa de crecimiento y resistencia a Spodoptera frugiperda, así como a la mancha foliar.

 

Tipos y origen de la variación somaclonal

El origen de las mutaciones que ocurren en el cultivo in vitro ha sido poco estudiado, más aún en loa pastos tropicales. Schuze et al. (citados por Pérez Ponce, 1992) analizaron los resultados de 20 investigaciones, de las cuales en 12 las mutaciones se produjeron a nivel nuclear, 5 en citoplasma y en 3 no fue posible determinar dónde ocurrieron, lo que indica que la herencia citoplasmática tiene un gran peso en la variación somaclonal.

Dentro de las mutaciones que ocurren en el núcleo, según Vázquez, Ana (comunicación personal), se ha informado la cromosómica, o sea, cambios estructurales y numéricos de los cromosomas, cambios génicos (monogénica y poligénica) y otros referidos a las transposiciones y mediaciones del DNA. Brown y Lörz (1986), en una reseña sobre este tema, han enfatizado la importancia de los cambios que ocurren en el DNA de las mitocondrias y de los cloroplastos durante el cultivo in vitro.

En el caso de las mutaciones, la mayoría de los investigadores han encontrado como causa fundamental la poliploidía, la aneuploidía y las mutaciones genómicas. Según Ahloowalia (1983), dentro de estas últimas se han informado todas las formas posibles de la genética mutacional clásicas: translocaciones, inversiones, delecciones y otras.

La poliploidía y la aneuploidía son las mutaciones más frecuentes in vitro, y puede detectarse desde el inicio del cultivo la inestabilidad cromosómica. En Pennisetum americanum Swedlung y Vasil (1985) informaron que el explante inicial tenía un 96% de células diploides, 25% tetroploides y 1,2% aneuploides. Al mes de cultivo el 92% fue diploide, aumentaron a 4% las tetraploides y a 47% las aneuploides. Con los subsiguientes subcultivos, a los varios meses de edad, hubo un 76% de diploides, 10% de tetraploides y 14% de aneuploides. Esto sugiere que las pocas células no diploides presentes en el explante inicial debieron tener una ligera ventaja selectiva durante la proliferación del callo, por lo que se incrementó su población.

En Medicago sativa, el cultivo in vitro permitió la obtención de 9 octaploides de 200 plantas regeneradas a partir de un clon tetraploide (cv Saranac) (Saunder y Bingham, 1972). Posteriormente, Saunder y Bingham (1975) detectaron 50 octaploides por doblaje espontáneo de los tetraploides Wang y Vasil (1983) plantaron segmentos de inflorescencias jóvenes de un genotipo enano de Napier (Pennisetum americanum x híbrido de Pennisetum purpureum) y observaron que no hubo una marcada variabilidad, ya que retuvieron su número triploide de cromosomas (3x = 21), excepto una de las variantes que fue hexaploide (6x = 42).

Son muy pocos los trabajos que abordan las mutaciones citoplasmáticas en los cultivos vegetales in vitro, situación que se acentúa más en los pastos tropicales. No obstante, en algunas gramíneas tales como el arroz y el trigo, se ha evidenciado por Palmer y Thompson (1982) que las variaciones obtenidas in vitro se deben a la presencia de dos grandes secuencias de DNA en los cloroplastos. También Day y Ellis (1984) encontraron selecciones del DNA cloroplástico y grandes segmentos invertidos y repetidos en plantas regeneradas de trigo.

En cuanto a los cambios del DNA mitocondrial, Gengenbach, Green y Donovan (1977) y Brettell, Goddard e Ingram (1979) regeneraron plantas de maíz resistentes a la toxina del hongo Drechslera maydis, cuyo donante me una línea altamente susceptible a la enfermedad (Texas Male Sterile citoplasm). Cuando la presión de selección fue aplicada por subcultivo de callos en presencia de la toxina, algunos regenerantes fueron no solamente resistentes a la enfermedad, sino también fértiles Los análisis de restricción del DNA mitocondrial de los regenerantes mostraron diferentes secuencias, donde hubo una gran alteración estequiométrica de los fragmentos.

Con respecto al DNA nuclear, se ha observado también que es afectado por el estrés de cultivo in vitro, con un gran incremento y una proporción aumentada de secuencias repetidas (De-Paepe, Prat y Huguet, 1982). Algunas investigaciones han concluido la existencia de procesos de síntesis de DNA, y tal amplificación, por lo tanto, puede ser solamente un paso primario de una cascada de eventos que permiten cambios en el desarrollo.

Los otros tipos de variación somaclonal son menos estudiados y requieren, en sentido general, de una gran atención por parte de los investigadores.

No obstante, como una nueva causa de variabilidad se informan los elementos genéticos móviles, las tramposomas. Producto de esta variabilidad novel aparecen mutantes que no existen o que son muy raros en la naturaleza, tales como: panículas múltiples en trigo, panículas triples en cebada, incremento en la altura y el vigor en el maíz y también mutantes resistentes a las fitohormonas, herbicidas, antibióticos, sales y metales (Ahloowalia, 1983).

Existen claras evidencias de que las mutaciones que ocurren in vitro son las mismas que ocurren in vivo por los métodos clásicos de la genética mutacional. A través del cultivo de tejidos se pueden obtener mutantes noveles, como es el caso donde se producen somaclones sexuales por aporte del citoplasma. Además se ha informado como otra causa de variabilidad el "crossing over mitótico".

Según Vázquez, Ana (comunicación personal), dentro de la variación somaclonal se pueden encontrar algunas rarezas que se observan en las plantas regeneradas. Entre ellas se mencionan: alta frecuencia de mutación para algunas especies, más de una mutación por planta, mutaciones dominantes, homocigosis, inestabilidad del mutante y segregaciones anormales.

 

Factores que afectan la variación somaclonal

De forma muy general, la variación somaclonal se origina de las mutaciones preexistentes en los tejidos que se emplean para los cultivos in vitro y de las que se producen debido al cultivo in vitro por sí mismo. Los factores que originan las mutaciones son: el genotipo, el explante, la edad de los cultivos y los medios de cultivo.

 

Genotipo

Anon (1986b) indicó determinadas evidencias en el sentido de que ciertos géneros, especies o genotipos con diferentes condiciones de ploidía son más propensos para la ocurrencia de variación espontánea que otros. Este aspecto ha sido bien determinado en muchos cultivos, no así en el caso de los pastos y forrajes en que los informes de la literatura son muy escasos.

No obstante, en caña de azúcar se ha confirmado la influencia que tiene el genotipo sobre la variación somaclonal, aunque es más importante para el mejoramiento genético el comportamiento particular del carácter que se quiere mejorar. En la variedad de caña B-4362, con un alto por ciento de variabilidad somaclonal, en una población de 50 000 regenerantes no se encontró ninguno resistente a la roya; por el contrario, en la variedad My-5450 con una baja variabilidad, se pudieron aislar mutantes resistentes al carbón (Liu, 1981). Por otra parte, la regeneración de plantas influye sobre la variabilidad somaclonal; a medida que esta sea de tejido más diferenciado, la variabilidad será menor, ocurriendo lo contrario cuando se regeneran tejidos menos diferenciados como el de los callos, al igual que los procedimientos físicos o químicos a que se someten los tejidos para la obtención de agregados o células simples Esto se evidenció en dos formas de regeneración de plantas en P. maximum cv. Likoni, ya que Saura et al. (1987) obtuvieron una alta variabilidad por organogénesis y Lajonchere, Mesa, Prieto y Toral (1994) demostraron la alta estabilidad genética de las plantas obtenidas por embriogénesis.

La influencia del genotipo sobre la variabilidad somaclonal puede estar dada por dos causas: una es que sea más inestable y que tenga un mayor número de mutaciones en el tejido y la otra es que los genotipos, al igual que en el caso de la regeneración, tengan variada respuesta a la variabilidad que se produce por cultivo in vitro"per se".

Jaramillo (1984) realizó estudios con diferentes genotipos, incluyendo algunos híbridos de S. guianensis en cultivo de anteras y organogénesis a partir de hojas, y observó que el genotipo influyó grandemente, tanto en la diferenciación de callos como de órganos.

También Godwin, Gordon y Cameron (1987) regeneraron plantas de 5 genotipos de S. guianensis a partir de callos derivados de hojas y notaron grandes diferencias genotípicas en cuanto al potencial morfogenético, que variaron desde 95 a 100% en los callos formadores de brotes del cv. Graham y a menos de 1% en el cv. Oxley. En sentido general, variaron caracteres como el albinismo, menor fertilidad, enanismo y morfología foliar.

En otras leguminosas se ha encontrado una gran variación genotípica para la regeneración de plantas, tales como Medicago sativa (Brown y Atanassov, 1985), Trifolium pratense (Phillips y Collins, 1979) y otras especies (Keyes, Collins y Taylor, 1980).

La variación genotípica en T. pratense para la embriogénesis somática fue atribuida a la varianza genética aditiva (Keyes et al., 1980); mientras que Reisch y Bingham (1981) informaron que la capacidad para la embriogénesis somática en genotipos diploides de alfalfa fue controlada por dos genes dominantes.

 

Explante

Para el inicio del cultivo in vitro se puede partir de cualquier tejido: somático o sexual. Si es somático, a la variabilidad que se obtenga se le denomina variación somática o somaclonal y si es sexual variación gametoclonal

Como se ha planteado, la causa de la variación genética son las mutaciones preexistentes en el tejido, por lo que el tipo de explante debe jugar un papel preponderarte.

Miles, Roca y Tabares (1989) estudiaron la variación somaclonal de S. guianensis CIAT-2243, en un medio con las sales orgánicas e inorgánicas del MS y suplementado con las vitaminas del B5 más 4 a 8 mg/l de 6-BAP y 0,5 mg/l de ANA, con dos tipos de explantes hojas maduras e hipocótilos. En total tuvieron 26 y 23% de tetraploides para cada tipo de explante respectivamente y el resto diploide. Estos investigadores notaron que el índice de tetraploidía no se vio afectado ni por el explante ni por el número de subcultivos y observaron además, en general, que la media de las líneas diploides fue diferente a la media de las líneas tetraploides y estas entre sí presentaron diferencias. Dichos autores concluyeron que la variación somaclonal será de utilidad en las actividades de mejoramiento genético, si la generación de esta variación puede combinarse con procedimientos de selección eficaces.

En Cajanus cajan L. (Milsp), Sarangi y Gleba (1991) utilizaron para la regeneración múltiple directa diferentes porciones de los embriones cigóticos: embriones enteros y embriones cortados en piezas de 0,5-1 mm; ellos observaron que las partes cotiledonales no adyacentes al eje embrionario no retuvieron el poder organogénico y, en sentido general, fue evidente la variabilidad genética obtenida.

Vázquez y Ruíz (1986) citan a algunos autores que han utilizado diferentes tipos de explantes: Scheunert utilizó secciones de raíces seminales de Hordeum vulgare y obtuvo un 80% de células diploides; Canoir Reynaerts y Jacobs obtuvieron callos derivados de embriones donde el 60% de las células fueron tetraploides y algunas con más de 100 cromosomas; Wilson observó células con diferentes niveles de ploidía en callos derivados de microsporas.

En sentido general, el uso de células meristemáticas o embriogénicas derivadas de ápices vegetativos e inflorescencias jóvenes pueden proveer una fuente genéticamente más estable que los tejidos diferenciados (Anon, 1986b).

 

Edad de los cultivos in vitro

Como se ha señalado anteriormente, las variaciones más comunes que ocurren en el cultivo in vitro son la poliploidía, la aneuploidía y las aberraciones cromosómicas. En estudios citogenéticos ha quedado demostrado que estos cambios aumentan proporcionalmente con la edad de los cultivos in vitro (Pérez Ponce, 1992), los que ocasionan la pérdida de la totipotencia de las células producto del elevado número de mutaciones que ocurren en ellas.

En S. guianensis (CIAT, 1986) se encontró que la capacidad regenerativa disminuyó de 46 a 16 y 3 para subcultivos sucesivos respectivamente, pero hubo una tendencia a aumentar la frecuencia de doblaje de los cromosomas; se observó además una relación entre el nivel de ploidía y los caracteres agronómicos Vázquez y Ruíz (1986) notaron en H. vulgare que los callos obtenidos de embriones mostraron una alta frecuencia de células diploides después de 4 meses de cultivo; esta predominancia de células diploides fue mantenida sobre un período de 3 años. Sin embargo, al inicio se observó cierta inestabilidad de los cromosomas.

En la tabla 1 se muestra cómo influye el período de tiempo sobre el número de cromosomas en callos derivados de embriones en H. vulgare.

Como se puede notar, el comportamiento de la variabilidad y la edad de los cultivos in vitro es muy importante cuando se aplica esta técnica en el mejoramiento genético.

 

Medios de cultivo

Uno de tos factores más importantes que gobiernan la morfogénesis en el cultivo de tejidos es la composición del medio.En los medios de cultivo existen dos formas de provocar variabilidad genética: la primera es debido a la influencia de las diferentes hormonas vegetales sobre el material hereditario, y la segunda es que los medios de cultivo condicionan la forma de regeneración.

En cuanto a la primera causa, el 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético) es la hormona más utilizada como agente mutagénico, ya que induce irregularidades en el proceso mitótico (Bayliss, citado por Vázquez y Ruíz, 1986).

Con el objetivo de incrementar de esta forma la variabilidad del germoplasma en Bothriochloa sp., Metzinger, Taliaferro, Johnson y Mitchell (1987) y Taliaferro, Dabo, Mitchell. Johnson y Metzinger (1989) condujeron un estudio donde originaron cambios genéticos en las plantas regeneradas con la concentración de 5 mg/l de 2,4-D. En las R1 las plantas tendieron a ser más pequeñas que las progenitoras y hubo un decrecimiento correspondiente en la longitud de las inflorescencias y racimos más bajos. El número de cromosomas se incrementó en dichas plantas. También en Cynodon sp. las concentraciones de 1 mg/l de 2,4-D provocaron callos embriogénicos que regeneraron posteriormente en medio libre de hormonas, mostrando una alta variabilidad entre los individuos. Este método de cultivo fue recomendado para el mejoramiento genético de las bermudas (Ahn, Huang y King, 1987; Arhmduaga et al., 1988) Sin embargo, en Medicago sativa la aplicación de 11 mg/l de 2,4-D produce una marcada embriogénesis sin perturbar la información hereditaria, por lo que esta técnica es utilizada para la producción de sencilla artificial (Brown y Atanassov, 1985). En Panicum sp. también se produce embriogénesis con el uso de esta hormona, pero en concentraciones menores sin cambios en el genoma.

En caña de azúcar se ha demostrado el efecto mutagénico que ejerce la Kinetina (N-(2-furamilmetil)-lH-purina-6-amina), ya que con la misma forma de regeneración (en este caso organogénesis a partir de callos) se obtuvieron valores de variabilidad distintos en dependencia del tipo y concentración de las hormonas empleadas.

Debemos señalar que el efecto del medio de cultivo está muy estrechamente unido a la edad de los cultivos in vitro, por lo que resulta muy difícil separar el efecto de ambos.

 

CONCLUSIONES

Con el desarrollo surge la Biotecnología, la cual va invadiendo todas las disciplinas y campos biológicos que hasta hoy domina el hombre; a ello han contribuido los avances en la biología molecular y puede ser aplicada para mejorar genéticamente los pastos en nuestro país.

Las aplicaciones de la biotecnología en el mundo actual abarcan todas las ramas y los métodos convencionales de mejora y producción de semillas Las fundamentales son: mejoramiento genético, propagación masiva, conservación de germoplasma y producción de metabolitos secundarios.

En cuanto al mejoramiento genético, esta nueva disciplina tiene como objetivo tres aspectos fundamentales: técnicas auxiliares, mejora por mutación somaclonal y transformación génica de las plantas.

La variación somaclonal es debida a los cambios que ocurren durante el período de crecimiento del callo. Estos cambios son derivados de las células aberrantes que preexistían en el explante o de disturbios fisiológicos causados por el ambiente de cultivo.

Los cambien genéticos que se pueden producir por el cultivo in vitro pueden ser a nivel nuclear y en el citoplasma, por lo que la herencia citoplasmática juega un papel importante en la variación somaclonal. Se ha informado que en el núcleo celular son los cromosómicos, cambios génicos, transposiciones y metilaciones del DNA los cambios más frecuentes, aunque el material genético de loa cloroplastos y mitocondrias sufren también cambios estructurales.

Las causas fundamentales de la variación somaclonal son la poliploidía, la aneuploidía y las mutaciones genómicas, y dentro de estas últimas las translocaciones, inversiones y delecciones.

Existen varios factores que afectan la variación somaclonal, entre ellos el genotipo, el explante, la edad de los cultivos in vitro y los medios de cultivo, entre otros.

Se ha podido demostrar que la variación somaclonal es de gran utilidad en el mejoramiento genético, siempre y cuando la generación de esta variación pueda combinarse con procedimientos de selección eficaces.

 

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Ahloowalia, B.S Spectrum of variation in somaclones of triploid ryegrass. Crop Sci. 23:1141. 1983

2. Ahn, B.J; Huang, F.H. & King, J.W. Plant regeneration through somatic embryogenic in common bermuda grass tissue culture. Crop Sci. 25:1107. 1985

3. Ahn, B.J.; Huang, F.H. & King, J.W. Regeneration of bermudagrass cultivars and evidence of somatic embryogenesis. Crop Sci. 27:594. 1987

4. ANON. Report of the 1st Research Coordination Meeting. In: In vitro technology for mutation breeding. International Atomic Agency. Vienna. p. 9. 1986a

5. ANON. Report of the 2nd Research Coordination Meeting. In: In vitro technology for mutation breeding. International Atomic Agency. Vienna. p. 25. 1986b

6. Artunduaga, .I.R.; Taliaferro, Ch.M. & Johnson, B.B. Effects of auxin concentration on induction and growth of embryogenic callus from young inflorescence explants of old world bluestem (Bothriochloa spp.) and bermuda (Cynodon spp.) grasses. Plant Cell Tissue and Organ Culture. 12:13. 1988

7. Bajaj, Y.P.S. In vitro production of haploids In: Handbook of plant cell culture. (D.A. Evans, W.R. Sharp, P.V. Ammirato and Y. Yamada, Eds.) MacMillan, N.Y. Vol. 1. p. 228. 1983

8. Bajaj, Y.P.S.; Sidhu, B.G. & Dubey, V.K. Regeneration of genetically diverse plants from tissue cultures of forage grass. Panicum sp. Euphytica. 30:135. 1981

9. Brettell, R.I.S.; Goddard, B.V.D. & Ingram, D.S. Selection of Tmscytoplams maize tissue cultures resistant to Drechslera maydis T-toxin. Maydica. 24:203. 1979

10. Brettell, R.I.S.; Wernicke, W. & Thomas, E. Embryogenesis from cultured immature inflorescence Sorghum bicolor. Protoplasma. 104:141. 1980

11. Brown, D.C.W. & Atanassov, A. Role of genetic background in somatic embryogenesis in Medicago. Plant Cell Tissue and Organ Culture. 4:11. 1985

12. Brown, P.T.H. & Lörz, H. Molecular changes and possible origins of somaclonal variation. In: Somaclonal variations and crop improvement. (Ed. Jean Semal). Martinus Nijhoff Publishers Dordrecht/ Bostom/Lancaster. p. 148. 1986

13. CIAT. Informe anual. Pastos tropicales. Documento de trabajo No. 24 CIAT, Colombia, p. 22-1. 1986

14. Combes, D. & Pernes, J. Polimorphisme et mode de reproduction dans la section maximae du genre Panicum (Gramineae ) en Afrique. Resumé des These de Doctorat. France. 1972

15. Crougham, S.S. & Hebert, K.M. Improvement of bermuda grass varieties through tissue culture. Forage and Grassland Conference, Lexington, N.Y. p. 131. 1988

16. Chandler, S.F. & Vasil, I.K. Optimization of plant regeneration from long term embryogenic callus cultures of Pennisetum purpureum Schum (Napier grass). J. Plant Physiol. 117:147. 1984

17. Chaume, R. & Savidan, Y. Panicum maximum, modole de manipulation genétique d'une graminee fourragére apomictique. Comunicatíon au 1er. Colloque Internatl en zone tropicale humidi. Bouake Cote d'Ivoire. p. 18. 1977

18. Cheng, Y.K. Callus induction and plant regeneratíon from inflorescence segments of pangola grass. Proc. XV Int. Grassld. Cong, Kyoto,Japan. p. 313. 1985

19. Day, A. & Ellis, T.H.N. Chloroplast DNA delections associated with wheat plants regenerated from pollen: possible basis for material inheritance of chloroplast. Cell. 39:359. 1984

20. De Paepe, R.; Prat. D. & Huguet, T Heritable nuclear DNA changes in doubled haploid plants obtained from pollen culture of Nicotiana sylvestris. Plant Sci. Lett. 28-11. 1982

21. Gengenbach, B.C; Green, C.E. & Donovan, C.D. Inheritance of selected pathotoxin resistance in maize plants regenerated from cell cultures. Proc. Nat. Acad. Sci. 74:5113. 1977

22. Godwin, L.D.; Oordon, G. & Cameron, D.F. Callus culture derived somaclonal variation in the tropical pasture Iegume Stylosanthes guianensis (Aubl.) Sw. Plant Breeding. Zeitschrift fur Pflazenzuchtung. 98:220. 1987

23. González, A.A. Estudio y selección de somaclones de la variedad JA 64-19 en condiciones de secano. Memorias Conf Cient X Aniv. del ISACA. Ciego de Ávila, Cuba. Vol. 1, p. 42. 1988a

24. González, A.A. Estudio y selección de somaclones de la variedad JA 8751 (Saccharum spp. híbrido) en condiciones de secano. Memorias. Conf. Cient. X Aniv. del ISACA Ciego de Ávila, Cuba. Vol. 1, p. 72. 1988b

25. Jaramillo, S. Cultivo in vitro de anteras y fragmentos de hojas de Stylosantbes spp. Rev. Facultad Nacional de Agronomía. 37:43. 1984

26. Karlson, Silvia B. & Vasil, I.K. Morphology and ultrastructure of embryogenic cell suspension cultures of Panicum maximum (guinea grass) and Pennisetum purpureum (Napier grass). Am. J. of Bot. 73:894. 1986

27. Keyes, G.J.; Collins, G.B. & Taylor, N.L.D Genetic variation in tissue cultures of red clover Theor. Appl. Genet. 58:265. 1980

28. Lajonchere, G.; Mesa, A.R.; Prieto, Marlenis & Toral, Odalys. Embriogénesis somática y regeneración de plantas a partir de ápices caulinares en Panicum maximum Jacq. cv. Likoni. Pastos y Forrajes. 16:201. 1994

29. Larkin, P.J. Somaclonal variation: history, method and meaning. Iowa State J. Res. 61:392. 1987

30. Larkin, P.J. & Scowcroft, W.R. Somaclonal variation a novel source of variability from cell cultures for improvement. Theor.Appl. Genet. 60:1. 1981

31. Liu, M.C. In vitro methods applied to sugar cane improvements. In: Plant Tissue Culture: Method and applications in agriculture. (Ed. Thorpe, T.A.). Academic Press, N.Y. p. 299. 1981

32. Lu, C.; Vasil, V. & Vasil, I.K. Isolation and culture of protoplasts of Panicum maximum Jacq (Guinea grass): somatic embryogenesis and plantlet formation. J. Pflanzenphysiol. 104:311. 1981

33. Meijer, E.G.M. Some aspects of longterm tissue culture of Stylosanthes guianensis (Aubl.) Sw. (Leguminoseae). J. Plant Physiol. 117:131. 1984

34. Metzinger, B.D.; Taliaferro, C.M.; Johnson, B.B. & Mitchell, E.D. In vitro regeneration of apomictic bluestem grasses. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 10:31. 1987

35. Miles, J.W.; Roca, W. & Tarares, E. Assessment of somaclonal variation in Stylosanthes guianensis, a tropical forage legume. 2nd International Symp. on Genetic Manipulation in Crops (Meijeeb Kazi, A. & Sitch, L.A. , Eds.). México, D.F. p. 249. 1989

36. Mroginski, L.A & Kartha, K.K Regeneration of plants from callus tissue of the forage legume Stylosanthes guianensis. Plant Sci. Lett. 23:245. 1981

37. Nagmani, R. & Venketeswaram, S. In vitro culture of hypocotyl and cotyledon segments of leucaena. Leucaena Res. Rep. 1:88. 1983

38. Palmer, J.D. & Thompson. W.F. Chloroplast DNA rearrangements are more frequent when a large inverted repeat sequence is lost. Cell. 29:537. 1982

39. Pereira, Madeline; Prieto, Marlenis & Ávila, Vivian. Caracterización isoenzimática de somaclones de Panicum maximum. Pastos y Forrajes. 13:237. 1990

40. Pérez, G.; Milanes, N.; Cabrera, L. & Morales, F Principales variedades de la caña de azúcar en producción y extensión en Cuba. INICA. La Habana, Cuba. p. 12. 1984

41. Pérez Padron, A.V. & González Rivero, A . Hibridación intereapecífica y rescate de embriones en el género Oryza en Cuba. Resúmenes 2do. Coloquio de Biotecnología de las Plantas y IV Symp. Internat. de Sanidad Vegetal en la Agricultura Tropical. Santa Clara, Cuba. p. 25. 1991

42. Pérez Ponce, J Caña de azúcar (Saccharum spp. híbrido). UCLV, Cuba. (Mimeo). 1988

43. Pérez Ponce, J. Variación somaclonal. En: Conferencias. Primer Curso FAO-Francia-Cuba sobre técnicas modernas de mejoramiento y multiplicación de especies agámicas. Instituto de Biotecnología de las Plantas Universidad Central de Las Villas, Cuba. 1992

44. Pérez Ponce, J. & Jiménez, E;. Introducción al cultivo in vitro. En: Conferencias. Primer Curso FAO-Francia-Cuba sobre técnicas modernas de mejoramiento y multiplicación de especies agámicas. Instituto de Biotecnología de las Plantas Universidad Central de Las Villas, Cuba.1992

45. Phillips, G.C. & Collins, G.B. In vitro tissue culture of selected legumes and plant regeneration from callus cultures of red clover. Crop Sci. 19:64. 1979

46. Reisch, B. & Bingham, E.T. Plants from ethionine resistant alfalfa tissue cultures: variation in growth and morphological characteristics. Crop Sci. 21:783. 1981

47. Sarangi, K.B. & Gleba, Y.Y. Direct multiple regeneration in Cajanus cajan L. (Millsp). Acta Hort. 289:149. 1991

48. Sasson, ABiotecnologies and developing countries: present and future to: Plant biotecnologies for developing countries. (Eds. A. Sasson and V. Costarini). Proc. of an Internat. Symp. organized by CTA and FAO, Luxemburgo. p. 23. 1989

49. Saunder, J.W. & Bingham, E.T. Production of alfalfa plants from callus tissue. Crop Sci. 12:804. 1972

50. Saunder, J.W. & Bingham, E.T. Growth regulator effects on bud initiation in callus cultures of Medicago sativa. Am. J. Bot.62:850. 1975

51. Saura, Carmen; Martínez, M.; Prieto, Marlenis & Santana, I. Regeneración de plantas a partir de cultivo de tejido en hierba guinea (Panicum maximum Jacq.). Pastos y Forrajes. 10:199. 1987

52. Scowcroft, W.R. & Larkin, P.J. Somaclonal variation: a new option for plant improvement. In: Plant improvement and somatic cell genetics (Eds. I.K. Vasil, W.R. Scowcroft & K.J. Frey). Academic Press, NY.p. 159. 1982

53. Swedlung, B. & Vasil, I.K. Citogenetic characterization of embryogenic callus and regenerated plants of Pennisetum americanum (L) K. Schum. Theor. Appl. Genet. 69:575. 1985

54. Szabados, L. & Roca, W.M. Regeneration of isolated mesophyll and cell suspension protoplasts to plants in Stylosanthes guianensis. A tropical forage legume. Plant Cell Reports. 3:174. 1986

55. Tabares, E.; Pineda, O.; López, P.; Szabados, L. & Roca, W. Búsqueda de variación somaclonal en Stylosanthes guianensis usando cultivo de tejidos En: IV Congreso Latinoamericano de Botánica, Medellín, Colombia. 1986

56. Taliaferro, C.M.; Dabo, S.M.; Mitchell, E.D.; Johnson, B.B. & Metzinger, B.D. MorphoIogical, citogenic and enzimatic variation in tissue culture regenerated plants of apomictic old world bluestem grasses (Bothriochloa sp.). Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 10:31. 1989

57. Torrey, J.C. Plant embryo. In: Tissue culture, methods and applications. (P.F. Kouse & M.K. Jr Patterson, Eds.). Academic Press, N.Y. p. 166. 1973

58. Vasil, I.K. Relative genetic stability of embryogenic cultures of the gramineae and uniformity of regenerted plants. In: Somaclonal variation and crop improvement. (Ed. Jean Semal). Martinus Nijhoff Publishers. Dordrecht/Boston/Lancaster. p. 108. 1986

59. Vázquez, Ana & Ruiz. M.L. Barley: Induction of genetic variability through callus cultures. In: Biotechnology in agriculture and forestry. (Ed. Y.P.S. Bajaj) Springer Verlag, Berlin. Vol. 2, p. 204. 1986

60. Wang, D.Y. & Vasil, I.K. Somatic embryogenesis and plant regeneration from inflorescence segments of Pennisetum purpureum Schum. Plant Sci. Lett. 25:147. 1983

61. Watt, Paula M.; Mycock, D.J. & Cresswell, C.F. Plant regeneration by somatic embryogenesis from leaf explants of Digitaria eriantha (Stend.) Subsp. Eriantha. Proc XVI Int. Grassld. Cong. Nice. France p. 421. 1989

 

 

 

Recibido el 30 de junio de 1993