ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN

 

 

 

Caracterización isoenzimatica de somaclones de Panicum máximum

 

 

 

Madeline Pereira, Marlenis Prieto y Vivian Avila
Estación Experimental de Pastos y Forrajes "Indio Hatuey" Matanzas, Cuba

 

 

 


RESUMEN

Se realizó un estudio isoenzimático en 11 somaclones obtenidos a partir de callos provenientes del meristemo apical de Panicum maximum cv. Likoni, con el objetivo de caracterizar sus genotipos y estudiar la variabilidad somaclonal producida, empleando un método electroforético. Se utilizaron dos sistemas enzimáticos: esterasas y peroxidasas. Las corridas electroforéticas se realizaron en geles continuos de poliacrilamida al 8,5% en presencia de buffer trisglicina 0,005 M pH= 8,3, una corriente de 50 MA, un voltaje de 150 volt y una temperatura de 4°C. Se observó un gran polimorfismo enzimático y se distinguieron 9 genotipos diferentes. Para los somaclones 6, 7 y 8 se obtuvieren patrones iguales en ambos sistemas en cuanto a número de bandas aunque en esterasas se observaron diferencias de intensidad, por lo que sería importante el empleo de otros sistemas isoenzimáticos para determinar la máxima variabilidad somaclonal obtenida.

Palabras claves: Isoenzimas, esterasas, peroxidadas, Panicum máximum.


ABSTRACT

Eleven lines obtained from callus coming from the apical meristem of Panicum maximum cv. Likoni were used for isoenzymatic study. The principal object of this study was to characterize genotypes and to extract information about genetic variability by means of electrophoresis. Two isoenzymatic systems were used: esterases and peroxidases. Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) was applied at 8,5% with the presence of trisglicine buffer 0,005 M pH= 8,3, temperature of 4°C, current of 50 MA and 150 volt. Great enzymatic polymorphism was observed and nine different genotypes were identified. Uniform patterns in both systems were found with the lines 5, 7 and 8 taking into account band numbers, although intensity differences in esterases were recorded. The use of others isoenzymatic systems are suggested in order to determine maximum genetic variability.

Additional index words: Isoenzymes, esterases, peroxidases, P. Maximum.


 

 

INTRODUCCIÓN

La electroforesis en geles de poliacrilamida constituye una de las técnicas de mayor resolución utilizadas en la separación de componentes moleculares.

Las isoenzimas, son formas moleculares múltiples de enzimas catalizadoras de un mismo tipo de reacción en un organismo dado. La separación electroforética de las mismas ha pasado a ser en las últimas dos décadas una técnica de amplia utilización en la diferenciación de cultivares de trigo (Autran y Feillet, 1987), en la determinación de correlaciones entre determinadas isoenzimas y caracteres de importancia para la selección en Oryza sativa (Gupta y Singh, citados por Simo, 1979), en la búsqueda de formas sexuales en una especie típicamente apocmíctica como Panicum maximum (Smith, citado por Simo, 1979), en el estudio de el efecto de los metales tóxicos sobre las múltiples formas de esterasas en Triticum aestivum cv. Vergina (Karataglis, Symeonidis y Moustakas, 1988) y para la diferenciación varietal en Stylosanthes (Robinson y Megarrity, 1975).

En nuestro país se ha incrementado la utilización de las caracterizaciones isoenzimáticas para la búsqueda de marcadores genéticos y diferenciación de variedades de Panicum maximum (Simo, 1979) y en la identificación de plántulas nucleares y zigóticas en el género Citrus (Iglesias, Lima y Simón, 1974).

Cruz, Miles, Roca y Ramírez (1989) emplearon el análisis electroforético de esterasas y proteínas totales en hojas para diferenciar 15 ecotipos de 3 especies de Brachiaria.

El objetivo de nuestro trabajo consistió en la caracterización y estudio de la variabilidad de genotipos obtenidos por cultivo de tejidos mediante el empleo de un método electroforético.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

El testigo Panicum maximum cv. Likoni y 11 clones obtenidos por cultivo de tejidos se sembraron en macetas en casa de cristal; a los 45 días se tomaron las hojas más jóvenes de las plantas para el análisis electroforético.

Para la preparación de los extractos crudos se utilizaron 0,2 g de tejido foliar. Estos fueron macerados en morteros previamente enfriados, se utilizó una solución amortiguadora según Robinson y Megarrity (1975) y posteriormente se centrifugó en frío a 3 000 rpm durante 30 minutos. El sobrenadante se tomó como extracto final para la corrida electroforética, que se realizó en una unidad vertical con alimentación de una fuente SHANDOR-SAE 2761 a un voltaje hasta 150 volt, una corriente constante de 50 MA y una temperatura de 4°C. Al gel se le aplicó 30 ml de extracto y la duración de la corrida fue de 4,30 horas.

Se emplearon geles continuos de poliacrilamida al 8,5%, buffer de corrida tris-glicina 0,005 M pH= 8,3 y como indicador de corrida bromofenol azul al 1%.

La tinción de esterasas se realizó según Hussain, Ramírez y Roca (1986) y las peroxidasas por Van Fleet (1959) modificado por Iglesias et al. (1974); una vez teñidos los geles se conservaron en ácido acético al 7%.

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

El zimoqrama obtenido para el sistema esterasas (fig. 1) evidenció el gran polimorfismo isoenzimático presente en esta especie, pues cada somaclón (del 1 al 11) presentó un patrón isoenzimático diferente al testigo (12) en el número e intensidad de las bandas.

Los somaclones 6, 7, 8 y 9 presentaron patrones isoenzimáticos iguales entre sí en cuanto al número y posición de las bandas, al igual que el 2 y el 11; pero se observaron acentuadas diferencias en la intensidad de las mismas, lo cual pudiera indicar diferencias genotípicas entre ellos.

El menor número detectado de isoesterasas fue 6, representadas en los patrones correspondientes a los somaclones 1 y 5 y el mayor número fue 10 presentes en el patrón exhibido por el somaclón 4.

Se destacaron dos zonas de migración electroforética; en la A se ubicaron las isoenzimas de bajo peso molecular y rápida migración y en la B se agruparon las de mediano peso molecular y migración intermedia; además se evidenció la ausencia de isoesterasas de alto peso molecular. Resultados similares fueron obtenidos por Simo (1979) al estudiar 12 variedades de Panicum maximum, quien encontró para este sistema isoenzimático una carencia absoluta de bandas proteicas pesadas.

En el zimograma de las peroxidasas (fig. 2) se obtuvieron patrones más uniformes y los somaclones 9 y 11 presentaron patrones de isoperoxidasas idénticos al testigo en el número, la posición y la intensidad de las bandas; el resto se diferenció del testigo solamente en el número de bandas.

Los somaclones 3, 4 y 5 presentaron patrones de isoperoxidasas iguales entre sí y reflejaron el mayor número de isoenzimas (14) detectado para peroxidasas durante este estudio; el menor número (9) estuvo representado en el patrón correspondiente al somaclón 1 donde se observó, fundamentalmente, una carencia de bandas proteicas de mediano peso molecular. Los somaclones 6, 7, 8 y 10 estuvieron también representados en este sistema por el mismo patrón isoenzimático.

En la figura 2 se diferenciaron, además, tres zonas de migración electroforética: las zonas A y B agruparon a proteínas de características similares a las isoesterasas en cuanto a peso molecular y migración electroforética y la zona C agrupó a las isoperoxidasas de alto peso molecular y migración electroforética lenta.

Para ambos sistemas isoenzimáticos se obtuvo una buena resolución y se observaron bandas comunes a todos los somaclones y al testigo; estas dan un criterio de similitud, lo cual es lógico, ya que todos los somaclones pertenecen a la misma especie.

Al analizar de forma integral los resultados obtenidos en ambos sistemas fue posible caracterizar 9 genotipos diferentes (tabla 1).

Los somaclones 6, 7 y 8 estuvieron representados por un mismo patrón isoenzimático en cada uno de los sistemas estudiados, lo que pudiera ser un indicador de la existencia de un genotipo común; pero en las esterasas se presentaron marcadas diferencias en la intensidad de las bandas, lo que se tradujo en diferencias cuantitativas. Ello sugiere ensayar otros sistemas enzimáticos para conocer la máxima variabilidad genética obtenida mediante esta técnica.

La identificación y caracterización de 9 genotipos diferentes corrobora la posibilidad de obtener variabilidad somaclonal en esta especie y se demostró, además, la utilidad de la electroforesis en la diferenciación de los genotipos.

 

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Autran, J.C. & Feillet, P. Genetic and technological basis of protein quality for durum wheat in pasta. In: Protein evaluation in cereals and legumes. Edited by V. Pattakou. p. 59. 1987

2. Cruz, R.; Miles, J.W.; Roca, W. & Ramírez, H. Rev. cubana Cienc. agríc. 23:301. 1989

3. Hussain, A.; Ramírez, H. & Roca, W.M. Manual práctico para la detección electroforética de isoenzimas y otras proteínas. Manual ClAT No. 19, p. 14. 1986

4. Iglesias, I.; Lima, H. & Simón, J.V. Heredity. 65:81. 1974

5. Karataglis, S.; Symeonidis, L. & Moustakas, M. J. Agronomy & Crop Sci. 160:106. 1988

6. Robinson, P.V. & Megarrity, R.G. Aust. J. Agric. Res. 26:467. 1975

7. Simo, P. Pastos y Forrajes. 2:1. 1979

8. Van Fleet, D.S. Can. J. Bot. 37:449. 1959

 

 

 

Recibido el 11 de julio de 1990