ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN

P. Simo

Estación Experimental de Pastos y Forrajes «Indio Hatuey» Matanzas, Cuba

RESUMEN

En el presente trabajo se estudia de modo preliminar el polimorfismo isoenzimático y la variabilidad intraespecífica encontrada para los patrones isoenzimáticos de peroxidasas y esterasas en hojas de 36 muestras representativas de la colección de guineas de la EEPF «Indio Hatuey», determinándose la presencia de 12 patrones isoenzimáticos diferentes para uno y otro sistema y presentándose un gran número de isoperoxidasas (30) y de isoesterasas (21). El amplio polimorfismo encontrado permite la utilización ventajosa de estas isoenzimas como marcadores genéticos, aunque debido a que un mismo patrón es compartido por varias plantas, es necesario profundizar en el estudio de estos sistemas y considerar, adicionalmente, otros órganos de la planta y otros sistemas isoenzimáticos.

Palabras clave: Isoenzimas, peroxidasas, esterasas, Panicum maximum.

INTRODUCCIÓN

La separación electroforética de formas moleculares múltiples de enzimas o isoenzimas, ha pasado a ser, en las últimas dos décadas, una técnica de amplia utilización en trabajos de Genética y de Mejoramiento. Debido a la relación directa gen-enzima y a la posibilidad de visualizar directamente los productos génicos múltiples catalizadores de una misma (o similar) reacción, se ha podido desarrollar el estudio del polimorfismo genético a nivel enzimático, utilizándose muy ventajosamente las isoenzimas como marcadores genéticos de gran utilidad en diversos trabajos de investigación.

Las bases de la electroforesis de zona utilizando gel como medio de soporte, fueron inicialmente desarrolladas por Smithies (1955), quien empleó el gel de almidón. Más tarde, Raymond y Weintraub en 1959 y Ornstein y Davis en el mismo año (citados por Brewer, 1970), introdujeron el gel de poliacrilamida, con un poder resolutivo mayor y algunas otras ventajas sobre los medios anteriormente usados (papel, agar, celulosa, almidón).

La utilización de isoenzimas como marcadores genéticos ha ido amplia, pese a lo relativamente reciente de esta técnica. En Cuba se han utilizado exitosamente para la
identificación de plántulas nucelares y zigóticas en el género Citrus (Iglesias, Lima y Simón, 1974). En gramíneas y leguminosas su utilización ha sido diversa: se han empleado con fines de clasificación varietal en Stylosanthes (Robinson y Megarrity, 1955) y en Digitaria (Smith, 1973); para la realización de estudios evolutivos en Oryza (Palanichamy y Siddiq, 1977) y en Glycine (Brové, Marshall y Müller, 1977); en la búsqueda de formas sexuales en una especie típicamente apomíctica como Panicum maximum (Smith, 1972), y en la determinación de correlaciones entre determinadas isoenzimas y caracteres de importancia para la selección, en Oryza sativa (Gupta y Singh, 1977) y en Stylosanthes guianensis (Robinson, Date y Megarrity, 1976).

En la hierba de guinea existe un amplio campo de aplicaciones posibles para el marcaje isoenzimático, y el mejoramiento genético de este pasto podría apoyarse en gran medida en el uso de las isoenzimas como marcadores. Con ese fin iniciamos el presente estudio, destinado a determinar métodos apropiados para el trabajo futuro en este y en otros pastos, a la vez que estudiando, de modo preliminar, el polimorfismo presente para peroxidasas y esterasas y las posibilidades de utilización de las isoenzimas como marcadores genéticos en esta especie.

MATERIALES Y MÉTODOS

El material vegetal usado para la preparación electroforética de isoperoxidasas e isoesterasas, procedía de parcelas experimentales en el campo. Se utilizaron hojas jóvenes de 36 clones, tomándose tres muestras por clon en el momento del muestreo (octubre), la mayor parte de los clones se encontraban en la fase reproductiva.

Las hojas fueron congeladas al menos 24 horas antes de la preparación de los extractos. Para preparar éstos se maceró 0,3 g de tejido foliar por cada muestra en 3 ml de solución de sacarosa al 40% en buffer de Trisgli- cina de pH 8,8 utilizando para la maceración morteros previamente enfriados. Posteriormente las muestras fueron centrifugadas, utilizándose solo el sobrenadante.

La electroforesis fue realizada en un sistema discontinuo de buffer y gel vertical de acrilamida, en un aparato diseñado por Chapel, Iglesias, Barreto, Bairse y Simon (1974). La lámina del gel estuvo compuesta por un gel de compactación al 4% en un buffer Tris-ClH de
pH 7,6 y un gel de separación preparado en buffer Tris-ClH de pH 8,9; probándose inicialmente diversas concentraciones de poliacrilamida entre 8,5 y 15%, y utilizándose posteriormente una concentración de 12,5%, con la que se logró una excelente diferenciación de bandas, en sentido general. Sin embargo, las bandas lentas de peroxidasas lograron una mejor separación entre sí a una concentración de 10,5%, por lo que los patrones electroforéticos para esa zona fueron determinados mediante electroforesis adicionales a esa concentración. Las cámaras correspondientes a los electrodos se llenaron con buffer Tris-glicina utilizando inicialmente un pH 8,3, aunque posteriormente se logró una más rápida migración y una mejor separación entre bandas (específicamente las peroxidasas rápidas) con un pH 8,8. Después de situar los extractos en el gel de compactación se aplicó una corriente eléctrica, probándose diversas variantes en los rangos de 100-220 V y 30-80 mA. Las condiciones que proporcionaron finalmente una relativamente rápida corrida sin afectar la calidad de los resultados, fueron un voltaje de 200 V con una intensidad correspondiente de aproximadamente 45 mA. El voltaje se mantuvo inalterable durante la electroforesis dejándose variar la intensidad de la corriente. La adición de 1 ml de solución de azul bromofenol al buffer de Tris-glicina se realizó inmediatamente antes de conectar la corriente eléctrica, con el fin de dar lugar a una banda frontal marcadora de la velocidad de la electroforesis (banda de Kohlrausch). La corrida electroforética se llevó a cabo directamente frente al flujo de aire de una unidad de aire acondicionado (10°C), probándose diferentes tiempos de corrida inicialmente y utilizándose después 4 horas 30 minutos como duración standard.

Al terminar la electroforesis el gel fue cortado en dos capas usando un cortador de geles (Brewer, 1970). Una mitad fue teñida para peroxidasas y la otra para esterasas.

La tinción de peroxidasas se efectuó mezclando 50 ml de solución de bencidina dihidroclórica al 2% en una solución de ácido acético al 14%, con 50 ml de H₂O₂ al 0,3% y sumergiendo el gel inmediatamente en dicha mezcla durante unos 20-30 segundos hasta que aparecían las bandas de color azul, después de lo cual se enjuagaba con H₂O destilada,
sumergiéndolo en ésta hasta que las bandas tomaban una coloración oscura, cambiando por último el H₂O por ácido acético al 10%.

La tinción para esterasas se llevó a cabo preincubando el gel durante una hora en ácido bórico 0,5 M (pH 6,0) en refrigeración y pasándolo luego a una mezcla de tinción consistente en 0,2 g de Fast Blue, 15 mg de 1-naftilacetato y 20 mg de 2-naftilacetato en 100 ml de buffer fosfato de pH 6,4. El 1-naftilacetato y el 2-naftilacetato fueron previamente diluidos en 2 ml de acetona cada uno. La reacción de tinción se llevó a cabo en la oscuridad durante aproximadamente dos horas.

RESULTADOS

Los patrones electroforéticos obtenidos para esteresas y peroxidasas muestran un gran polimorfismo isoenzimático y una apreciable variabilidad intraespecífica, aunque no entre clones de un mismo tipo o cultivar.

Los cultivares o tipos de guinea estudiados, con sus correspondientes clones, agrupados de acuerdo a los 12 patrones electroforéticos encontrados tanto para peroxidasas como para esterasas, tal como se reflejan en las figuras 1 y 2, se presentan en la tabla 1.

Tanto esterasas como peroxidasas dieron patrones electroforéticos relativamente complejos, los que para simplificar su estudio hemos dividido en tres zonas en cada caso, de acuerdo a la movilidad electroforética y teniendo en cuenta además, en el caso de las esterasas, la diferencia en coloración de sus bandas. Las zonas diferenciadas, correspondientes a bandas de migración rápida (A), media (B) y lenta (C), serán denominadas provisionalmente PX-A, PX-B .y PX-C en el caso de las peroxidasas, y Est-A, Est-B y Est-C en el caso de las esterasas.

Esterasas. En la figura 1 se presentan los 12 patrones encontrados para isoesterasas, manifestándose una variación apreciable para las tres zonas, especialmente para la intermedia, Est-B, formada íntegramente con bandas coloreadas de rojo, a diferencia de las isoenzimas rápidas (Est-A) y lentas (Est-C) que tomaron un color pardo oscuro. Sólo una isoenzima (Est-A8) fue común a todos los clones estudiados, mientras que diversas bandas aparecieron como patrimonio exclusivo de ciertos clones.

El número total de isoesterasas encontrado fue de 21, correspondiendo 8 a la zona Est-A, 7 a la Est-B y 6 a la Est-C. Algunas plantas carecieron por completo de isoenzimas en alguna de las zonas, como en el caso del cv. Colonial y el tipo conocido como Gigante Azul, que no presentaron isoenzimas Est-B. El menor número de isoesterasas encontradas en una misma muestra fue de tres (Gigante Verde) y el mayor, de ocho (Azul Enano e IH 572).

Peroxidasas. Los 12 patrones encontrados para peroxidasas se muestran en la figura 2 En total se encontraron 30 bandas diferentes, de las cuales 9 corresponden a la zona PX-A, 11 a la PX-B y 10 a la PX-C

La zona de bandas rápidas (PX-A) aparece claramente separada del resto, no ocurriendo lo mismo con las zonas PX-B y PX-C en algunas muestras, por lo que su delimitación fue hecha un tanto arbitrariamente. Cuatro isoperoxidasas (PX-A7, PX-B4, PX-B5, PX-C8) fueron comunes a todas las muestras en estudio. Algunas bandas fueron características de un sólo patrón isoenzimático, como en el caso de la PX-A1 en el patrón correspondiente a la var. Trichoglume y a la forma conocida como Pubescente pequeño, o la banda PX-B1 que caracteriza sólo al tipo Enano peludo (fig. 2).

El número total de isoenzimas presentes en una misma planta tuvo en este caso un mínimo de 11 (cv. Colonial, Gigante azul) y un máximo de 16 (Pubescente mediano, Enano peludo).

DISCUSIÓN

Las modificaciones realizadas en nuestro laboratorio a las técnicas de trabajo iniciales, se han efectuado con el objetivo de lograr una mejor resolución de las bandas isoenzimáticas para los dos sistemas en estudio y pueden aun ser ulteriormente perfeccionadas. En particular, se hace necesaria una técnica standard que combine niveles satisfactorios de resolución tanto en peroxidasas lentas como en rápidas.

La presencia de un gran polimorfismo isoenzimático para peroxidasas y esterasas en la guinea había sido reportada anteriormente por Smith (1972).

El gran polimorfismo isoenzimático encontrado en general, y en cada planta en particular en el presente trabajo, parece confirmar indirectamente la condición poliploide reconocida en esta especie (Whyte, Moir y Cooper, 1959; Jauhar y Joshi, 1969), así como su carácter híbrido y
altamente heterocigótico, teniendo en cuenta su condición predominantemente apomíctica y considerando la relación generalmente existente entre este tipo de reproducción y el carácter híbrido de los grupos de plantas que lo presentan (Darlington, 1939; Stebbins, 1941; Williams, 1963). Ambos factores, poliploidía y heterocigosidad, posibilitarían combinaciones génicas, y por tanto isoenzimáticas, complejas y altamente variables.

Sin embargo, como puede verse por los resultados obtenidos en el presente estudio, pese a manifestarse una variabilidad intraespecífica relativamente apreciable para los sistemas isoenzimáticos estudiados, es notable la repetición de patrones en plantas consideradas hasta el momento como representantes de clones diferentes entre sí en nuestra colección de guineas, y podría concluirse que se trata, en cada caso, de repeticiones de un mismo clon ampliamente propagado, colectadas en diversos sitios, lo cual no seria extraño en una especie tan predominantemente apomíctica como la guinea. De acuerdo con esta apreciación, no habría diferencias genotipicas entre las diversas formas agrupadas dentro de cada una de las 12 categorías de la tabla 1, y es probable que sea así en un gran número de casos. Para aclarar esto sería necesario determinar y comparar patrones isoenzimáticos obtenidos para diferentes órganos de la planta y en distintos estadios de ésta, así como estudiar un número mayor de sistemas isoenzimáticos diferentes.

Sin embargo, algunos supuestos clones con un mismo patrón de isoenzimas se han diferenciado suficientemente en caracterizaciones morfológicas o agronómicas anteriores como para ser considerados, indudablemente, como poseedores de genotipos específicos: ese sería el caso del llamado ecotipo «Tardío pequeño» como ejemplo más evidente, aunque también de otras formas, sobre todo dentro del grupo «común», en el que algunas (IH 127, IH 421) se han destacado sobre otras en rasgos de valor agronómico (Simo y de la Paz, 1978).

Especialmente entre algunos clones comunes se presentaron diferencias cuantitativas que no son reflejadas en las figuras 1 y 2, respecto a algunas bandas isoenzimáticas, en particular PX-B4, PX-B5 y Est-B1. Teniendo en cuenta el carácter poliploide generalizado en esta especie y la posibilidad de formación de aneuploides a partir de formas tetraploides y
hexaploides, se podría pensar que además de repetirse indeterminadamente ciertos clones en el material estudiado, otros, aunque diferentes entre sí para algunos caracteres, fueran sólo variaciones en número cromosómico a partir de un mismo tipo básico poliploide y heterocigótico para muchos loci, sin que se alterase la composición cualitativa de los genes codificadores para las isoenzlmas estudiadas, aunque sí las proporciones de dichos genes en los distintos genotipos, lo cual produciría variaciones isoenzimáticas cuantitativas y explicaría las diferencias en la intensidad de ciertas bandas entre diferentes clones con un mismo patrón cualitativo.

Por otra parte, es posible también que determinadas combinaciones génicas para las isoperoxidasas e isoesterasas, como las que corresponden a los patrones característicos del tipo común, hayan sido fuertemente favorecidas mediante selección natural e incluso que esto haya ocurrido en bloque, es decir, que algunos, si no todos los genes correspondientes, formasen parte de grupos de ligamiento caracterizados por conferir un alto valor adaptativo a la planta, de modo que el efecto fuera el mantenimiento de una composición génica relativamente estable para estos sistemas isoenzimáticos.

Para aclarar estos aspectos, seria necesario primeramente estudiar la forma de herencia de las isoenzimas en cuestión, mediante pruebas de progenie en plantas de reproducción sexual.

Los resultados del presente trabajo, pese a las restricciones encontradas en la variabilidad intraespecífica, muestran la gran potencialidad que supone el polimorfismo isoenzimático en esta especie para su utilización, junto a la necesaria caracterización morfológica y citogenética del material, con fines de diferenciación, clasificación y establecimiento de relaciones taxonómicas entre las diferentes formas presentes, lo cual podría conducir a una mejor comprensión y por tanto a mayores posibilidades de aprovechamiento del germoplasma en el mejoramiento genético. Un ordenamiento adecuado del material en colección, debe preceder, o al menos acompasar a la caracterización agronómica de las plantas que se utilicen como material básico en el proceso de mejoramiento genético. La relativamente fácil determinación
de los patrones isoenzimáticos, unido al hecho de ser una directa expresión del genotipo, les otorgan un gran valor taxonómico.

En particular se ha señalado la importancia de contar con una caracterización isoenzimática del material desde el inicio mismo del proceso de mejoramiento (Simon, 1973), no sólo por las posibilidades que esto brinda para los estudios poblacionales, sino también por la gran simplificación que puede ofrecer al desarrollo del proceso de mejoramiento en sí, en cuanto a la elección de los progenitores más adecuados los cruzamientos y a la facilitación del proceso de selección.

En cuanto al primer aspecto se ha puesto de manifiesto la posibilidad de predecir la heterosis positiva, mediante el análisis del grado de diferenciación de los patrones de diferentes sistemas isoenzimáticos entre las plantas con posibilidades de ser usadas como progenitoras, sustituyendo con esto largos y complejos ensayos dialélicos, que requieren incomparablemente más tiempo, trabajo y recursos (Simon, 1973)

Por otra parte, tal como demostrara Smith (1972), el grado de variación isoenzimática en las progenies de plantas de guinea puede ser utilizado con efectividad como índice del grado de apomixis o sexualidad de los progenitores, a la vez que se hace posible caracterizar y diferenciar los híbridos obtenidos por cruces entre una planta sexual (progenitor femenino) y otra apomíctica (progenitor masculino) con patrones isoenzimáticos diferentes. Evidentemente, estas eran y siguen siendo por el momento algunas de las formas de utilización del marcaje isoenzimático más aprovechable para el mejoramiento genético de este pasto, y en dirección ya se encuentran orientadas algunas investigaciones en nuestro laboratorio.

Muchas de las bandas isoenzimáticas detectadas por nosotros son exclusivas de un cultivar o clon determinado y por tanto podrían utilizarse como marcadores en cualquier cruzamiento en que dicha planta fuese utilizada como progenitor masculino, a la vez que son marcadores ideales para la identificación del propio biotipo en caso necesario. Claros ejemplos de esta posibilidad lo constituyen las isoesterasas Est-C1 del tipo «Pubescente mediano» y Est-C6 de los cv. Likoni y Uganda, o la peroxidasa PX-B1 del tipo Enano peludo. En muchos otros casos,
una banda es común a algunos clones pero diferencial a otros, por lo que puede ser también empleada con los mismos fines en cruzamientos apropiados.

Por otra parte, la posible correlación entre algunas isoenzimas marcadoras y caracteres de importancia agronómica, tal corno ha sido determinado en algunas especies, en particular en relación con la resistencia a enfermedades (Sági y Mesterhazy, 1977) o a condiciones ambientales extremas (Titov, 1978), con la eficiencia de la nodulación en una leguminosa (Robinson, Date y Megarrity, 1976) y con el peso del grano en una gramínea (Gupta y Singh, 1977), entre otros casos, plantea otro camino importante de investigación, pues el establecimiento de dichas correlaciones facilitaría grandemente el proceso de selección del material hibrido en futuros programas de cruzamientos, en que por las grandes cantidades de «seedlings» que generalmente se producen, se hace difícil un evaluación agronómica de un mínimo de rigor para todo el material.

Como se ha visto, las posibilidades de utilización de las isoenzimas como marcadores genéticos en las plantas, son diversas y de importancia para el mejor desarrollo del mejoramiento genético. El presente trabajo pretende abrir un camino a las futuras investigaciones que deberán realizarse al respecto, en la hierba de guinea y en otras gramíneas y leguminosas pratenses. La diversificación y profundización de tales investigaciones, incluyendo el trabajo con otros sistemas isoenzimáticos de importancia, deben dar respuesta en un futuro a las necesidades de los programas de mejora genética de pastos en nuestro país.

SUMMARY

The peroxidase and esterase polimorphism and intraspecific variation have been preliminary studied for leaves of 36 accessions of guinea grass, representative of the guinea grass germplasm of the Indio Hatuey Experimental Station. 12 different isozyme patterns have been determined by electrophoresis for both isozyme systems, a great number of isoperoxidases (30) and isoesterases (21) being found. This great polimorphism allows the advantageous utilization of peroxidase and esterase isozymes as genetic markers in this species, although because of different plants sometimes present the same isozyme pattern, it is necessary to
develop more the study of these isozymes and to consider additionally other plant tissues and isozyme systems.

AGRADECIMIENTOS

A María Elena Catony y Acela Tamayo, por su colaboración técnica en la realización de las electroforesis y a los Licenciados Hiraldo Lima y Adelaida Barreto, del Laboratorio de Isoenzimas de la Facultad de Biología de la Universidad de La Habana, por su contribución al montaje de las técnicas isoenzimáticas en nuestro laboratorio.

REFERENCIAS

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