ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN
Población fungosa asociada al proceso germinativo de semillas almacenadas de Leucaena leucocephala cv. Perú
Fungal population associated to the germination process of stored seeds of Leucaena leucocephala cv. Peru
J. C. Lezcano1, O. Alonso1 y Marlen Navarro1
1Estación Experimental de Pastos y Forrajes Indio Hatuey,
Universidad de Matanzas, Ministerio de Educación Superior. Central España Republicana, CP 44280, Matanzas, Cuba.
Correo electrónico: lezcano@ihatuey.cu
RESUMEN
El objetivo de esta investigación fue identificar los hongos asociados a semillas de Leucaena leucocephala cv. Perú almacenadas, durante la prueba de germinación. Para ello se realizó un análisis micológico a simientes con 6 y 18 meses de almacenadas (400 en cada caso, en cuatro réplicas de 100), que provenían del almacén de la finca de semillas La Rioja ?perteneciente a la Empresa Pecuaria Martí (provincia Matanzas, Cuba)?. Los agentes fungosos se identificaron con la ayuda de claves taxonómicas, y los datos relacionados con el número de semillas germinadas, semillas con síntomas de enfermedad y podridas por hongos se procesaron mediante el sistema de comparación de proporciones. Se diagnosticaron 11 especies fungosas: Penicillium expansum; Aspergillus flavus, aislamientos 2, 3 y 4; Aspergillus niger; Fusarium oxysporum; Trichoderma sp.; Pestalotia sp.; Rhizopus stolonifer; Cladosporium sphaerospermum y Aspergillus wentii. Entre estas sobresalió la primera, con un máximo de 11,25 % de infección en las semillas de 18 meses podridas. Los principales síntomas fueron: decoloración seminal, manchas en los cotiledones y necrosis de la radícula. Se concluye que las especies de hongos halladas pertenecen a siete de los géneros más representativos, los que provienen del campo y del almacén. El agente fungoso P. expansum afectó en mayor cuantía a las semillas germinadas y las podridas. Solo seis de las 11 especies de hongos provocaron los principales síntomas detectados (P. expansum, A. flavus aislamiento 2, A. niger, F. oxysporum, Trichoderma sp. y Pestalotia sp.).
Palabras clave: Almacenamiento de semillas, hongos, leguminosas forrajeras.
ABSTRACT
The objective of this research was to identify the fungi associated to stored seeds of Leucaena leucocephala cv. Peru, during the germination test. For such purpose a mycological analysis was performed on seeds with 6 and 18 months of storage (400 in each case, in four replications of 100), from the storehouse of La Rioja seed farm _belonging to the Livestock Production Enterprise Martí (Matanzas province, Cuba)_. The fungal agents were identified with the aid of taxonomic keys, and the data related to the number of germinated seeds, seeds with disease symptoms and seeds rotten by fungi were processed through the system of comparison of proportions. Eleven fungal species were diagnosed: Penicillium expansum; Aspergillus flavus,isolates 2, 3 and 4; Aspergillus niger; Fusarium oxysporum; Trichoderma sp.; Pestalotia sp.; Rhizopus stolonifer; Cladosporium sphaerospermum and Aspergillus wentii. Among them the first one stood out, with a maximum of 11,25 % of infection in the rotten 18-month seeds. The main symptoms were: seed discoloration, spots on the cotyledons and necrosis of the radicle. It is concluded that the fungal species found belong to seven of the most representative genera, which come from the field and the storehouse. The fungal agent P. expansum showed the highest infection percentage in the germinated and rotten seeds. Only six of the 11 species of fungi caused the main detected symptoms (P. expansum, A. flavus isolate 2, A. niger, F. oxysporum, Trichoderma sp. and Pestalotia sp.
Keywords: Forage legumes, fungi, seed storage.
INTRODUCCIÓN
Las semillas almacenadas constituyen una alternativa importante en los programas de cultivo de plantas de un país, y representan un vínculo esencial con las generaciones sucesivas. Sin embargo, como cualquier organismo vivo, pueden ser afectadas por numerosos factores, como la temperatura, la humedad, la presión de oxígeno, así como por roedores, insectos plagas y patógenos; los cuales, en estrecha interrelación, las deterioran y disminuyen su vigor y calidad (Doria, 2010).
Según Ridao (2003), la asociación de los patógenos con las semillas no solo ocasiona pérdidas directas de las poblaciones de plantas en el campo, sino también efectos irreversibles en todo un sistema agrícola. Para un gran número de enfermedades de naturaleza devastadora, la semilla representa el vehículo ideal de diseminación y perpetuación de sus agentes causales, y es donde persiste la fuente del inóculo que es capaz de infectar el nuevo cultivo que se siembre. De ahí la importancia de evaluar el factor sanidad, conjuntamente con los indicadores porcentaje de germinación, pureza y vigor, para determinar la calidad de un lote de semilla.
Sin embargo, en las semillas de Leucaena leucocephala cv. Perú almacenadas no se han realizado estudios profundos, por lo que la información disponible sobre el tema es escasa e insuficiente en Cuba y a nivel mundial. No obstante, la literatura especializada informa que Alternaria, Aspergillus, Botrytis, Cladosporium, Curvularia, Doratomyces, Fusarium, Helminthosporium, Macrophomina, Nigrospora, Penicillium, Chaetomium, Pestalotia y Rhizopus representan los géneros fungosos que más se asocian a dichas simientes en condiciones de almacenamiento al ambiente (Alonso et al., 1996; Lezcano et al., 2007).
Además, Lezcano et al. (2007) también detectaron diversos síntomas de enfermedad en las semillas de esta leguminosa, tales como: decoloración de las cubiertas seminales, pudrición, manchas en los cotiledones y muerte de las radículas, los que provocan la reducción significativa de su germinación y la pérdida o disminución de su viabilidad. Por ello, es necesario realizar estudios sobre la micoflora más importante asociada a estas semillas, para determinar su posible control.
El objetivo de la investigación fue identificar los principales hongos asociados a las semillas de L. leucocephala cv. Perú almacenadas, durante la prueba de germinación.
MATERIALES Y MÉTODOS
La investigación se realizó en el laboratorio de protección de plantas de la Estación Experimental de Pastos y Forrajes Indio Hatuey _Matanzas, Cuba_, y en el laboratorio de micología vegetal del Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria _Mayabeque, Cuba.
Procedencia de las muestras. Las muestras, colectadas en el almacén de semillas de la finca de semillas La Rioja _perteneciente a la Empresa Pecuaria Martí, provincia Matanzas, Cuba_, fueron semillas germinadas (SG) y podridas (SP) de L. leucocephala cv. Perú, con 6 y 18 meses de almacenadas al ambiente, que mostraron signos de agentes fungosos o síntomas de sus enfermedades; estos fueron detectados durante la prueba de germinación.
Prueba de germinación y procedimiento para la identificación de los hongos. La prueba de germinación se realizó según las recomendaciones del ISTA (1999) para las arbóreas tropicales, y los conteos de germinación se efectuaron cada tres días. Se empleó un diseño completamente aleatorizado; los tratamientos estuvieron representados por los tiempos de almacenamiento, y para cada uno se emplearon 400 semillas (100 por réplica). Estas se distribuyeron en cuatro cápsulas Petri de cristal _estériles, de 15 cm de diámetro_ que contenían dos láminas de papel de filtro _también estériles_ que fueron utilizadas como sustrato inerte, y otras dos usadas para su tapado, a las cuales no se les aplicó ningún tratamiento. Durante el experimento (21 días), las cápsulas se mantuvieron en incubación, en condiciones controladas de luz (plena oscuridad) y temperatura (25 °C como promedio).
Las semillas que mostraron signos de hongos o síntomas de enfermedades fueron retiradas. Entonces se procedió al aislamiento del agente causal (con la ayuda de agujas previamente desinfectadas, y de un microscopio estereoscopio Zeiss SV-6 _lentes oculares desde 10 hasta 100 x_), a la obtención de los cultivos puros y, finalmente, a su correspondiente identificación hasta el nivel de género y/o especie, según Martínez et al. (1992) e ISTA (1999).
Las claves utilizadas para la identificación de los hongos, según los caracteres culturales y morfológicos, fueron las propuestas por: Raper y Fennell (1965), Onions (1966a, 1966b, 1966c), Booth (1969), Rifai (1969), Ellis (1971), Lunn (1977), Sutton (1980), Barnett y Hunter (1999), Ho et al. (1999) y López (2003).
Mediciones. Se calculó el porcentaje de infección causada por hongos en las SG y las SP con 6 y 18 meses de almacenadas; para ello se tuvo en cuenta el total de SG y SP en cada tiempo de almacenamiento (284 y 104 para las de 6 meses; 19 y 122 para las de 18 meses). Asimismo, se midió el número de semillas germinadas con síntomas de enfermedades fungosas o signos de estos agentes (SGCSE) y el número de semillas podridas por hongos (SP).
Análisis estadístico. Los datos relacionados con la infección de los agentes fungosos en las semillas durante la germinación se procesaron mediante el sistema de comparación de proporciones _versión 2.1_ (CENSA, 1998).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En las semillas de L. leucocephala cv. Perú con 6 y 18 meses de almacenadas al ambiente se identificaron 11 agentes fungosos, que pertenecen a los géneros: Penicillium, Aspergillus, Fusarium, Rhizopus, Pestalotia, Cladosporium y Trichoderma.
En la tabla 1 se muestra la micoflora asociada a las simientes con 6 meses de almacenadas. Los hongos Penicillium expansum Link y Aspergillus niger van Tieghem fueron los que más infectaron las SGCSE; aunque el porcentaje de infección de Aspergillus flavus aislamiento (aisl.) 2 no difirió de estos dos agentes fungosos. En el caso de las SP, P. expansum también originó la mayor afectación, y la diferencia estadística fue superior respecto a los restantes hongos.
Es importante señalar que la infección en las SGCSE fue superior, debido a la existencia de una mayor cantidad de tejido vegetal susceptible (cubiertas seminales, hojas cotiledonales y radículas) que estuvo expuesto a la acción de los hongos (fig. 1a); mientras que en las SP, la infección solo se localizó en aquellas que no germinaron o en su cubierta (fig. 1b). Por otra parte, los valores de pudrición seminal no sobrepasaron el 6 % de infección, lo que confirmó, además, la escasa afectación que produjeron los hongos.
En cuanto a la población fungosa asociada a las semillas de L. leucocephala cv. Perú con 18 meses de almacenadas (tabla 2), el hongo P. expansum causó el porcentaje de infección más significativo tanto en las SGCSE como en las SP, y difirió estadísticamente del resto de los agentes fungosos. Además, la mayor afectación fungosa ocurrió en las SP (fig. 2), con presencia de una mayor cantidad de especies; entre ellas sobresalieron Aspergillus flavus aisl. 4 y Aspergillus wentii Wehmer, que no fueron informadas con anterioridad en las SGCSE ni en las semillas con 6 meses de almacenadas.
El aumento de la micoflora presente en las SP (tabla 2) demostró que la infección se incrementó con el transcurso del tiempo de almacenamiento, ya que se observó una mayor multiplicación, reproducción y desarrollo de las siguientes especies: P. expansum, A. flavus aisl. 2, A. flavus aisl. 3, Rhizopus stolonifer, Cladosporium sphaerospermum y Trichoderma sp., lo que favoreció el deterioro acelerado y la muerte de las semillas infectadas.
Según Schmidt (2000), los hongos que pertenecen a los géneros Penicillium y Aspergillus constituyen los principales agentes que afectan a las semillas ortodoxas en condiciones de almacenamiento; en esta categoría se agrupan las simientes del género Leucaena. Soetrismo (2003) señaló que, junto con las especies de Rhizopus, esta es la micoflora más común en las semillas almacenadas, particularmente en las de L. leucocephala. Estos resultados coinciden con los obtenidos por Sahu y Agarwal (2004), quienes informaron para esta leguminosa, además, la presencia de las especies: A. flavus, A. niger, Alternaria alternata, Alternaria tenuissima, Apiospora montagnei, Arthrinium euphorbiae, Aspergillus fumigatus, Curvularia clavata, Curvularia lunata [Cochliobolus lunatus], Fusarium sp., Fusarium pallidoroseum (syn. Fusarium semitectum), Paecilomyces variotii, Penicillium chrysogenum y Phoma sp.
Otro aspecto importante fue el considerable aumento de la concentración de solutos lixiviados en las semillas podridas con 18 meses de almacenadas, debido al daño causado por los microorganismos a los tejidos y, particularmente, a la membrana celular; el cual fue más evidente en las semillas afectadas por Aspergillus (A. flavus), Penicillium, Cladosporium y Fusarium. Según Halloin (1986), por lo general este daño es consecuencia directa o indirecta de la presencia de enzimas extracelulares de los microorganismos (celulasas, pectinasas, lipasas, proteasas y nucleasas) y sus toxinas, las que también son responsables de la inhibición del crecimiento normal de las plántulas en numerosos cultivos (Howlett, 2006). Además, Latiffah et al. (2014) señalan que el establecimiento de los hongos en las semillas perturba su actividad metabólica, y los tejidos nutritivos son consumidos por los microorganismos fúngicos, lo que provoca que disminuya la viabilidad. Asimismo, en las simientes se puede apreciar decoloración seminal y pérdida de la capacidad de germinación (FAO, 2010).
Sin lugar a dudas, las especies que se identificaron representan la micoflora más importante asociada a las semillas de L. leucocephala, lo que coincide con lo informado por Alonso et al. (1996).
En el caso específico de la infección por Fusarium, se confirmó lo informado por Borges y Urdaneta (2010), respecto a que este agente reduce la germinación y ocasiona la pudrición y muerte de las plántulas. Tales resultados coinciden con lo reportado por Gally et al. (2006) acerca de que Fusarium spp. y Phomopsis spp. incrementan el número de semillas muertas y afectan la emergencia de las plántulas de soya (Glycine max L.).
Existen diversos informes sobre la incidencia de P. expansum, A. flavus, A. niger, R. stolonifer y Fusarium oxysporum asociados a semillas de numerosas especies de plantas a nivel mundial, tales como: Moringa oleifera Lamarck, Jatropha curcas, Vigna unguiculata L. Walp., Cajanus cajan L., Phaseolus vulgaris L., Arachis hipogea L., G. max y Zea mays (Jayaraman et al., 2011; Rathod et al., 2012; Costa et al., 2013; Ghangaokar y Kshirsagar, 2013; Martínez et al., 2013; Martínez et al., 2014; Rajuskar y Taware, 2014).
Es importante destacar que existió una estrecha relación entre los síntomas de las enfermedades y la micoflora, ya que se constató la vinculación casi directa de la decoloración seminal con la incidencia de P. expansum, A. niger, Pestalotia sp., Trichoderma sp., A. flavus aisl. 2 y F. oxysporum; así como la presencia de manchas en los cotiledones y la necrosis de las radículas causadas por A. flavus aisl. 2 y F. oxysporum. A partir del diagnóstico patológico realizado, estas especies fungosas se pueden considerar como patógenos que afectan a las semillas de la leguminosa evaluada.
Por otra parte, aunque P. expansum y A. niger (fig. 3) produjeron decoloración de las cubiertas seminales, también pueden provocar la pudrición de las semillas germinadas y su muerte, por lo que se reduciría la germinación y la emergencia de plántulas. Esto coincide con lo informado por Sadhu (2014) para A. niger, en simientes y plántulas de Vigna radiata L.
En la literatura relacionada con L. leucocephala cv. Perú no se ha hallado información acerca de los efectos negativos que ejercen los agentes fungosos antes mencionados, ni sobre el proceso germinativo. Sin embargo, se señala que durante el almacenamiento las especies de Aspergillus y Penicillium provocan el deterioro acelerado de las semillas, a través de su calentamiento, la pérdida de sus propiedades nutritivas, la producción de toxinas, la pudrición y la pérdida de la viabilidad (Anon, 2010).
Asimismo, se informa que en el almacén los hongos que pertenecen a estos dos géneros representan la microflora más común y causan las mayores infecciones en las simientes (Amaral y Lemos, 2009), aspecto que se corroboró en las semillas de L. leucocephala en la presente investigación.
La menor incidencia que ejerció F. oxysporum en las semillas almacenadas es característica de los hongos de campo, los que muestran su supremacía en esas condiciones (temperatura y humedad relativa altas).
CONCLUSIONES
Las 11 especies fungosas halladas durante la germinación de las semillas de L. leucocephala cv. Perú pertenecen a siete géneros representativos de los hongos provenientes del campo y del almacén: Fusarium, Pestalotia, Cladosporium, Penicillium, Rhizopus, Trichoderma y Aspergillus.
El hongo que más infectó las semillas de ambas edades de almacenamiento (germinadas y podridas) fue P. expansum, el que alcanzó su máxima expresión en las putrefactas de 18 meses.
Los principales síntomas que aparecieron en las simientes fueron: la decoloración (causada por P. expansum, A. niger, Pestalotia sp., Trichoderma sp., A. flavus aisl. 2 y F. oxysporum), las manchas en los cotiledones y la necrosis de la radícula (ocasionadas por A. flavus aisl. 2 y F. oxysporum).
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Recibido el
25 de enero de 2015
Aceptado el 3 de febrero de 2015
