ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN

Inoculación de trigo (Triticum aestivum, L.) con rizobios adaptados a ecosistemas ganaderos de Sancti Spiritus, Cuba

Inoculation of wheat (Triticum aestivum, L.) with rhizobia adapted to livestock ecosystems from Sancti Spiritus, Cuba

C.J. Bécquer¹, Beatriz Salas¹, D. Archambault², J. Slaski² y A. Anyia²

¹Estación Experimental de Pastos y Forrajes Sancti Spíritus, Cuba. E-mail: becquer@pastos.yayabo.inf.cu
²Department Environmental Technologies, Alberta Research Council, Vegreville, AB, Canada. E-mail: slaski@arc.ab.ca

RESUMEN

Se efectuó un ensayo de invernadero con el objetivo de seleccionar cepas de rizobios inoculadas en trigo (Triticum aestivum, L., var. CDC Teal), así como determinar las interrelaciones de dependencia entre algunas variables. Se utilizaron 30 cepas procedentes de leguminosas naturalizadas de Sancti Spíritus, Cuba, pertenecientes al género Bradyrhizobium sp., así como 12 cepas comerciales. Los inóculos se confeccionaron en medio CLM y fueron agitados hasta alcanzar un título de 10⁶-10⁸ cél./mL. Se utilizaron métodos estándar para la inoculación de cereales. El diseño experimental fue de bloques al azar con 44 tratamientos y cuatro réplicas. Un tratamiento se fertilizó con NH₄NO₃ (150 ppm N/kg^-1). Se construyó un dendrograma mediante el método de Ward y se hallaron los coeficientes de regresión. Se constató un incremento significativo de los valores en todas las variables (excepto en el peso seco de las espigas) de los tratamientos inoculados, comparados con el testigo absoluto. Se seleccionaron 20 cepas como altamente promisorias sobre la base de los valores estadísticos alcanzados en las variables estudiadas. Los tratamientos seleccionados, cuyos valores fueron estadísticamente superiores a los del control absoluto, constituyeron el 47% en los inoculados con cepas nativas y el 50% en los inoculados con cepas comerciales; y existió una mayor dependencia estadística entre el PSR y las variables de mayor representatividad productiva en los tratamientos inoculados con cepas comerciales.

Palabras clave: Inoculación, Rhizobium, Triticum aestivum.

ABSTRACT

A greenhouse essay was carried out with the objective of selecting rhizobia strains inoculated to wheat (Triticum aestivum, L., var. CDC Teal), as well as determining the dependence interrelations between some variables. Thirty strains from naturalized legumes of Sancti Spiritus, Cuba, belonging to the Bradyrhizobium sp. genus, as well as 12 commercial strains, were used. The inoculi were prepared in BYM medium and shaken until they reached a titer of 10⁶-10⁸ cel./mL. Standard methods were used for the inoculation of cereals. A randomized block experimental design with 44 treatments and four replications was used. A treatment was fertilized with NH₄NO₃ (150 ppm N/kg^-1). A dendrogram was built through the Ward method and the regression coefficients were found. A significant increase was observed in the values of all the variables (except in the dry weight of the ears) of the inoculated treatments. Twenty strains were selected as highly promising based on the statistical values reached by the variables studied. The treatments selected, which values were statistically higher than those of the absolute control, constituted 47% of the ones inoculated with native strains and 50% of the ones inoculated with commercial strains; and there was a higher statistical dependence between the RDW and the variables of higher productive representativeness in the treatments inoculated with commercial strains.

Key words: Inoculation, Rhizobium, Triticum aestivum.

INTRODUCCIÓN

El trigo (Triticum aestivum, L.) constituye un cereal importante desde el punto de vista alimenticio, tanto para el ser humano como para los animales. Este posee ventajas en su producción sobre otros cereales, como el arroz y el maíz. Es mucho más eficiente en el uso del agua (produce más grano por unidad de agua) y su rango geográfico sobrepasa grandemente al del arroz y el maíz, por lo que se adapta a los lugares fríos y también a los moderadamente calientes. En Cuba desde el año 1956 se obtuvo la primera variedad nacional y posteriormente, en el Instituto de Investigaciones Fundamentales de Agricultura Tropical (INIFAT), se han obtenido siete variedades resistentes a las condiciones edafoclimáticas del país (Gutiérrez, Pérez, Cabrera, Villasana, López-Cervantes, Uranga, Díaz-Esquivel y Marrero, 2005), por lo que el estudio de los factores biológicos con potencial suficiente para aumentar su productividad es una tarea de gran importancia para el desarrollo sostenible de la agricultura.

Por otra parte, se conoce el efecto beneficioso de los rizobios como bacterias fijadoras del nitrógeno atmosférico en las leguminosas a través de la simbiosis leguminosa-rizobio. Estas bacterias son utilizadas ampliamente en el mundo para el incremento de la producción de grano y forraje, con un ahorro sustancial de divisas y una contribución significativa al cuidado del medio ambiente. De acuerdo con investigaciones recientes, estas bacterias pueden colonizar también las raíces de las plantas no leguminosas. La infección rizobiana en dichas especies probablemente sea más común en la naturaleza que lo que se consideraba (Matiru y Dakora, 2004). Según Dakora (2003), los rizobios producen diversos metabolitos como auxinas, citoquininas, riboflavinas y vitaminas, los cuales pueden actuar como sustancias promotoras del crecimiento vegetal.

Al contar con cepas de rizobios que han sido aisladas y caracterizadas con técnicas de fisiología microbiana y biología molecular, y evaluadas en cuanto a su capacidad de fijación de nitrógeno atmosférico en leguminosas (Bécquer, Prévost y Cloutier, 2001; Bécquer, Prévost, Cloutier y Laguerre, 2002; Bécquer, 2003), y dada la importancia que tiene la introducción del trigo y otros cereales en la agricultura cubana, el objetivo del presente estudio fue la selección de cepas de rizobio sobre la base de su efecto positivo en diversos indicadores fisiológicos de la planta, así como determinar las posibles interrelaciones de dependencia estadística entre las variables de mayor representatividad productiva.

MATERIALES Y MÉTODOS

Identificación de las cepas de rizobio. Se utilizaron 30 cepas procedentes de leguminosas naturalizadas de Sancti Spíritus, Cuba (Centrosema, Neonotonia y Stylosanthes). Estas cepas fueron confirmadas en trabajos anteriores como rizobios y ubicadas taxonómicamente en el género Bradyrhizobium sp. (Bécquer et al., 2002). Se utilizaron también 12 cepas comerciales pertenecientes a diferentes géneros y especies de rizobio (tabla 1).

Preparación de inóculos. Los inóculos se confeccionaron en medio CLM (caldo-levadura-manitol) (Somasegaran y Hoben, 1994) a partir de una asada de cultivos frescos en medio agarizado. Los inóculos se colocaron en agitación (120 rpm) durante siete días (para las especies de lento crecimiento) o de tres a cuatro días (especies de rápido crecimiento) en una zaranda orbital a 30^oC, hasta alcanzar un título UFC (unidad formadora de colonias) de 10⁶-10⁸ cél./mL.

Ensayos de invernadero. Se escogió una variedad de trigo (CDC Teal) donada por Alberta Research Council, Canadá. Las semillas fueron pregerminadas previamente. Se utilizaron métodos estándar para la inoculación de los cereales (Sabry, Saleh, Batchelor, Jones, Jotham, Webster, Kothari, Davey y Cocking, 1997; Biswas, Ladha y Dazzo, 2000), con cambios en la frecuencia y la cantidad de inóculo. Así, un inóculo bacteriano en cantidad de 3 mL/planta, que contenía 10⁶-10⁸ cél./mL, fue aplicado a los cinco días de la siembra y, consecutivamente, se realizaron otras inoculaciones (6 mL/planta y 12 mL/planta, respectivamente), a los 20 y 30 días de la siembra.

Diseño experimental y análisis estadístico. Se empleó un diseño en bloque al azar con 44 tratamientos y cuatro réplicas. Se incluyó un control absoluto y uno con un portador nitrogenado (NH₄NO₃, 150 ppm N/kg^-1). Se realizó un ANOVA (SAS, 1999-2000, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA); las diferencias entre medias se hallaron mediante la dócima de comparación de Duncan (1955) y se tomó en consideración la desviación estándar (DE). Se construyó un dendrograma mediante el método de Ward (distancia euclidiana al cuadrado) (StatGraphics Plus, versión 2.0, 1994-1996, Statistical Graphics Corporation) y se hallaron los coeficientes de regresión (r²) y correlación mediante la aplicación del paquete estadístico antes mencionado. Se evaluaron las variables: peso seco aéreo (PSA), peso seco raíz (PSR), longitud del tallo (LT), peso seco espigas (PSE), rendimiento de granos (REND.) y peso de 1 000 granos (P1000G).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Selección de cepas de rizobio

Es conocido que los rizobios producen fitohormonas que promueven el crecimiento vegetal y, posiblemente, incrementen los rendimientos, a pesar de no haber sido detectada alguna fijación de N₂ en las especies no leguminosas (Matiru y Dakora, 2004). En el presente experimento se constataron resultados estadísticamente superiores cuando se inoculó el trigo con cepas pertenecientes a diferentes géneros (tabla 2). En la variable peso de 1 000 granos se determinó que los tratamientos inoculados con las cepas nativas TE4, HA1, HA3, HG2, JH1, JH2, SP1, SP4, SP8, SP12, SP15, SP21, SP22 y SP23, pertenecientes a Bradyrhizobium sp., así como las cepas comerciales 25B6 y 61B7 (Bradyrhizobium sp.), ORS 571 (Azorhizobium caulinodans), USDA 191 (Sinorhizobium fredii) y ATCC 10317 (Bradyrhizobium lupini), mostraron los valores estadísticos superiores, con diferencias significativas (P<0,01) respecto al testigo absoluto. Ocho de estos tratamientos mencionados anteriormente tuvieron superioridad estadística en comparación con el control absoluto en la variable longitud del tallo, aunque existieron otros más en esa variable que resultaron superiores al testigo absoluto, tales como: HA1, HG2, JJ2, JJ4, JK1, JK3, JK6, SP9, SP20 y SP21 (Bradyrhizobium sp.), así como ATCC 10004 y ATCC 14480 (Rhizobium leguminosarum).

Otros tratamientos que fueron inoculados con las cepas de Bradyrhizobium sp.: TD1, TD4, TE1, JJ2, SP6 y SP7, R. leguminosarum ATCC 10004 (peso seco raíz y peso seco aéreo); Bradyrhizobium sp.: TD4, JJ2, JK1, JK3, SP16 y SP18; R. loti MSDJ 865, Bradyrhizobium sp.: SP4 (peso seco de las espigas) y JJ4 y SP16 (rendimiento de granos), así como Sinorhizobium meliloti ATCC 9930 (rendimiento de granos), también presentaron resultados estadísticamente superiores con respecto al testigo absoluto (tabla 2). Höflich, Wiehe y Köhn (1994) observaron que la inoculación con R. leguminosarum incrementó de forma significativa la materia seca aérea del maíz, del trigo de primavera y de la cebada de primavera. Así mismo, Hilali, Prévost, Broughton y Antoun (2001) determinaron que el incremento en el rendimiento de grano en trigo inoculado con R. leguminosarum fue de 23-25% en comparación con el testigo absoluto. Otros autores, como Biswas et al. (2000), obtuvieron valores estadísticos superiores en el rendimiento de grano al inocular arroz con cepas pertenecientes a Rhizobium sp., R. leguminosarum y Bradyrhizobium sp.

Las variables longitud del tallo y peso de 1 000 granos se caracterizaron por presentar un mayor número de tratamientos de igual significación estadística (letras comunes) con respecto al testigo fertilizado (19 tratamientos en peso de 1 000 granos, 19 en longitud del tallo, cinco en peso seco raíz y dos en peso seco de las espigas), así como un mayor número de tratamientos superiores al control absoluto (tabla 2). Los valores en la primera variable indican claramente el efecto de la inoculación en el crecimiento de la planta, debido quizás a la acción directa de algunas de las fitohormonas responsables de dichos procesos, secretadas por los rizobios; mientras que en la segunda pudieran indicar una consecuencia directa de una mejor absorción de nutrientes, al mejorar la morfología radicular de las plantas con la inoculación.

Al construir un dendrograma (fig. 1) sobre la base de las variables estudiadas, se constató la formación de cinco conglomerados con los tratamientos que presentaron valores estadísticamente superiores, donde se destacaron los tratamientos inoculados con las cepas: TD4, JH1, JJ2, HA1, JH2, SP8, SP4, SP12, ATCC 10317, HG2, 25B6, USDA 191, SP1, SP15, SP21, HA3, 61B7, SP23, ATCC 10004 y ORS571, las cuales resultaron promisorias para su utilización en futuros ensayos de campo. Esta agrupación permitió determinar que de los tratamientos inoculados con las cepas nativas, el 47% se destacó por sus resultados estadísticamente superiores; mientras que en los inoculados con cepas comerciales la selección fue del 50%. No obstante, resulta obvio que la mayor parte de las cepas seleccionadas correspondieron a las nativas, lo cual representa un potencial importante de utilización de los recursos microbianos locales en la inoculación de trigo en futuras prácticas agronómicas.

Análisis de regresión entre variables

Un aspecto de interés lo constituyen los análisis de regresión efectuados al evaluar todos los tratamientos inoculados indistintamente con cepas nativas o comerciales y las variables de mayor representatividad desde el punto de vista productivo. Estos análisis mostraron que existió una regresión débil (r²= 0,046%) entre las variables peso seco raíz y longitud del tallo (fig. 2), peso seco raíz y rendimiento (r²= 5,60%) (fig. 3), así como entre peso seco raíz y peso de 1 000 granos (r²= 4,15%) (fig. 4).

Al efectuar dichos análisis por separado, se constató que para los tratamientos inoculados con cepas nativas también la regresión fue débil (peso seco raíz y longitud del tallo: r²= 3,88%, peso seco raíz y rendimiento: r²= 0,72% y peso seco raíz y peso de 1 000 granos: r²= 0,059%, respectivamente) (figs. 5, 6 y 7). Sin embargo, en los tratamientos inoculados con cepas comerciales la regresión fue fuerte para esas mismas variables (r²= 34,50%, r²= 37,39% y r²= 53,36%, respectivamente) (figs. 8, 9 y 10), lo cual indica una alta dependencia de estas variables respecto al desarrollo radicular. Esto pudiera apuntar hacia un efecto inducido en la planta con la secreción de hormonas de diferente naturaleza química por los diferentes géneros de rizobio constituyentes de las cepas comerciales utilizadas. Según Biswas et al. (2000) los microorganismos diazotrofos pueden promover el crecimiento vegetal mediante la transferencia del N₂ fijado o el mejoramiento de la absorción de nutrientes a través de la modulación de actividades hormonales relacionadas en las plantas inoculadas. Lupwayi y Clayton (2004) plantearon que los rizobios pueden actuar como promotores del crecimiento vegetal y cambiar la fisiología y morfología de las raíces inoculadas, lo que resulta en una mayor absorción de N y otros nutrientes.

No debe descartarse que los géneros y especies de rizobios presentes en las cepas comerciales utilizadas pueden diferenciarse de las cepas nativas de Bradyrhizobium sp. en cuanto al modo de incidir en la morfología y fisiología de las raíces y, por ende, influir positivamente en los valores de las variables de importancia productiva, como las que se han presentado en este trabajo.

No obstante, estas observaciones no invalidan la selección de las cepas relacionadas anteriormente (fig. 1), sino que muestran la existencia de procesos bioquímicos en la interacción planta-microorganismo que es necesario estudiar en futuros ensayos.

De acuerdo con los resultados, se constató un incremento significativo de los valores en todas las variables, excepto en peso seco espigas en los tratamientos inoculados al compararlos con el testigo absoluto. Se seleccionaron 20 cepas de rizobio como altamente promisorias, sobre la base de los valores estadísticos alcanzados en las variables estudiadas. Los tratamientos seleccionados, cuyos valores fueron estadísticamente superiores a los del control absoluto, constituyeron el 47% en los inoculados con cepas nativas y el 50% en los inoculados con cepas comerciales; y existió una mayor dependencia estadística entre el PSR y las variables de mayor representatividad productiva en los tratamientos inoculados con cepas comerciales.

Con el fin de profundizar y darle continuidad a estos estudios, se recomienda: efectuar ensayos de campo con las cepas seleccionadas en los cereales de interés económico para Cuba; realizar ensayos donde se inoculen diferentes genotipos de cereales para seleccionar los tratamientos de mejor interacción genotipo vegetal-cepa de rizobio; y estudiar las bases bioquímico-fisiológicas del efecto de los rizobios en los cereales.

AGRADECIMIENTOS

El financiamiento, así como las instalaciones, equipos y materiales utilizados para este trabajo, fueron provistos por Alberta Research Council (Vegreville, Alberta, Canadá), a través de un proyecto de colaboración con la Estación Experimental de Pastos y Forrajes Sancti Spíritus, Cuba. Los autores agradecen profundamente a todos los funcionarios de la institución canadiense anteriormente mencionada, especialmente al Dr. Daniel Archambault y al Dr. Jan Slaski, quienes se esforzaron en hacer realidad este proyecto.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Bécquer, C.J. Avances en los estudios de la fijación biológica del nitrógeno en la Estación Experimental de Pastos y Forrajes Sancti Spiritus. Memorias V Taller Internacional sobre Recursos Fitogenéticos. EEPF Sancti Spiritus. Sancti Spiritus, Cuba. p. 34. 2003

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11. Sabry, S.R.S.; Saleh, S.A.; Batchelor, Caroline; Jones, J.; Jotham, J.; Webster, G. ; Kothari, S.L.; Davey, M. & Cocking, E.C. Endophytic establishment of Azorhizobium caulinodans in wheat. Proc. R. Soc. Lond. 264:341. 1997

12. Somasegaran, P. & Hoben, H.J. . Handbook for rhizobia. Springer-Verlag, New York. 450 p. 1994

Recibido el 6 de Julio del 2006
Aceptado el 25 de julio del 2006