ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN

Acción antihelmíntica de seis extractos de morera en la viabilidad de larvas infestantes(L₃) de nemátodos gastrointestinales

D.E. García¹, Mildrey Soca¹ y María G. Medina²

¹ Estación Experimental de Pastos y Forrajes "Indio Hatuey"Central España Republicana, C.P. 44280, Matanzas, Cuba
E-mail: DGarcia@indio.atenas.inf.cu
²Instituto de Investigaciones Agrícolas (INIA), Estado Trujillo, Venezuela

RESUMEN

Con el objetivo de evaluar la actividad de seis extractos de Morus alba (Linn.) variedad Cubana en la viabilidad de larvas infestantes (L₃) de nemátodos gastrointestinales, se llevó a cabo una investigación con un diseño totalmente aleatorizado y cinco réplicas por tratamiento. Los extractos evaluados a partir del fraccionamiento fitoquímico fueron: extracto etanólico crudo (EEC), extracto etanólico fraccionado (EEF), extracto acuoso crudo (EAC), extracto acuoso fraccionado (EAF), extracto alcaloidal (EA) y el extracto clorofórmico (EC), en los cuales se investigó la presencia de los compuestos mayoritarios y su comprobación con patrones químicamente puros por cromatografía de capa delgada (TLC). Los géneros de parásitos encontrados en los cultivos fueron Trichostrongylus y Haemonchus. Los mayores índices de mortalidad correspondieron a los EAC y EAF, en los cuales la mortalidad fue superior al 80% durante la primera hora y llegó a ser de 96% al cabo de los 120 minutos. Los EEC y EEF causaron mortalidades inferiores (20-40% en todo el período de evaluación); mientras que los EA y EC no mostraron una actividad apreciable (0% a los 60 minutos y 0-20% a las 48 horas). La mortalidad causada por la adición de los extractos acuosos (EAs) presentó diferencias significativas favorables con relación a los extractos etanólicos (EEs), el EA y el EC. Los primeros signos de disminución de la vitalidad de las larvas comenzaron desde el mismo instante de haber sido agregados los EAs y EEs, debido a la presencia de compuestos polifenólicos mayoritarios, tales como los flavonoides (Quercetina y Rutina), las cumarinas (Umbeliferona) y los fenoles simples (Resveratrol). Los resultados permiten concluir que los metabolitos secundarios polifenólicos presentes en M. alba tienen una actividad antihelmíntica considerable en las larvas L₃ de los géneros Trichostrongylus y Haemonchus en condiciones in vitro.

Palabras clave: Antihelmínticos, metabolitos, Morus alba, nematoda.

ABSTRACT

With the objective of evaluating the activity of six extracts from Morus alba (Linn.) variety Cubana on the viability of infesting larvae (L₃) of gastrointestinal nematodes, a study was carried out with a completely randomized design and five replications per treatment. The extracts evaluated from the phytochemical fractioning were: crude ethanolic extract (CEE), fractionated ethanolic extract (FEE), crude aqueous extract (CAE), fractionated aqueous extract (FAE), alkaloidal extract (AE) and chloroformic extract (CE), in which the presence of the main compounds and their verification with chemically pure patterns by means of thin layer chromatography (TLC) were studied. The parasite genera found in the cultures were Trichostrongylus and Haemonchus. The highest mortality rates belonged to the CAE and FAE in which mortality was higher than 80% during the first hour and got to be 96% after 120 minutes. The CEE and FEE caused lower mortality rates (20-40% during the whole evaluation period); while the AE and CE did not show a noticeable activity (0% at 60 minutes and 0-20% at 48 hours). The mortality rate caused by the addition of the aqueous extracts (AEs) showed favourable significant differences with regards to the ethanolic extracts (EES), the AE and CE. The first signs of vitality decrease in the larvae started from the very moment the AEs and EES were added, due to the presence of main polyphenolic compounds, such as flavonoids, cumarins and simple phenols. The results allow to conclude that the polyphenolic secondary metabolites present in M. alba have considerable anthelmintic activity on L₃ larvae of the genera Trichostrongylus and Haemonchus under in vitro conditions.

Key words: Anthelmintics, metabolites, Morus alba, nematodes.

INTRODUCCIÓN

En el área tropical el parasitismo gastrointestinal es uno de los problemas fundamentales que afectan la producción animal, por lo que se ha hecho necesario el establecimiento de programas integrales de control que consideran, además de la aplicación estratégica de fármacos sintéticos, aspectos tales como: la rotación de potreros (Mendoza de Gives, 2000), la suplementación (Torres-Acosta, 2002) y la selección genética (Waller, 1998).

Por otra parte, muchas especies de árboles y arbustos forrajeros contienen metabolitos secundarios que presentan acción antihelmíntica contra algunos géneros de parásitos gastrointestinales, por lo que estas propiedades pueden ser usadas de forma práctica para contrarrestar dicha problemática, si se logra que las arbóreas formen parte de las dietas de los animales en los sistemas de alimentación (Hoste, 2002).

Las propiedades antiparasitarias de las plantas forrajeras han generado innumerables investigaciones en el campo de la parasitología y la fitoquímica (Vinent, 2003), en las cuales se han caracterizado las fuentes vegetales que contienen, fundamentalmente, taninos condensados y sus efectos en la reducción del conteo fecal de huevos (Pietrosemoli, Olavez, Montilla y Campos, 1999; Molan, Hoskin, Barry y McNabb, 2000), la población de parásitos en el tracto gastrointestinal y su relación con el sexo (Hoste, 2002), la viabilidad de las larvas (Molan et al., 2000) y el efecto de los taninos condensados y su repercusión en la dieta de animales parasitados (Githiori, Hoglund, Waller y Leyden, 2003).

En este sentido, algunas investigaciones sobre el metabolismo secundario de la morera indican que la especie presenta propiedades antihelmínticas (Duke, 2001); el extracto acuoso tiene acción antilarvicida fuerte en condiciones de laboratorio (Soca, García y González, 2004) y la variedad Cubana contiene la mayor concentración de polifenoles totales en la época de seca (García, 2003).

Teniendo en cuenta estos antecedentes, la investigación tuvo como objetivo evaluar el efecto antihelmíntico de seis extractos de metabolitos secundarios de la morera (variedad Cubana), en la viabilidad de larvas infestantes (L₃) de nemátodos gastrointestinales en condiciones de laboratorio, así como determinar, desde el punto de vista cualitativo, cuáles de los metabolitos presentan dichas propiedades.

MATERIALES Y MÉTODOS

La investigación se llevó a cabo en los laboratorios de Parasitología y Evaluación de alimentos de la Estación Experimental de Pastos y Forrajes "Indio Hatuey", situada a los 22º 48'7'' de latitud norte y 81º 2' de longitud oeste, a 19 msnm, en el municipio de Perico, provincia de Matanzas, Cuba.

Tratamientos y diseño experimental. Se evaluaron seis tratamientos en un diseño totalmente aleatorizado, con cinco réplicas.
A) Extracto etanólico crudo (EEC).
B) Extracto etanólico fraccionado (EEF).
C) Extracto acuoso crudo (EAC).
D) Extracto acuoso fraccionado (EAF).
E) Extracto alcaloidal (EA).
F) Extracto clorofórmico (EC).

Análisis estadístico. Se realizó un análisis de varianza simple, para lo cual se utilizó el paquete estadístico SSPS versión 10.0 para Windows; se empleó la dócima de comparación de SNK (Student-Newman-Keuls) y las medias fueron comparadas para un nivel de significación de P<0,05.

• Recolección del material vegetal. El material vegetal (hojas-pecíolos-tallos tiernos) fue recolectado en el período poco lluvioso (febrero) del 2004, en una plantación de M. alba var. Cubana, de 120 días de edad y fertilizada con 300 kg de N/ha/año a partir de cachaza.
• Obtención de los extractos. Los extractos madres se prepararon por maceración en el disolvente específico durante 72 horas: el EEC al 2% (volumen/volumen) mediante la dilución de un extracto etanólico madre al 25% (masa/volumen); el EEF a partir del EEC, al cual se le extrajo los compuestos poco polares con partes iguales de cloroformo y éter de petróleo; el EAC al 2% (volumen/volumen) mediante la dilución de un extracto acuoso madre al 25% (masa/volumen); el EAF a partir del EAC, al cual se le extrajo los compuestos poco polares de igual forma que al EEC; el EA mediante el fraccionamiento del EEC, fundamentado en la obtención de la fracción C₁ descrita por Alfonso, Fernández, González y Avilés (2000); y el EC a través del fraccionamiento del EEC, basado en la obtención de la fracción B descrita por Alfonso et al. (2000).
• Redisolución de los extractos. Con el objetivo de obtener extractos homogéneos en cuanto al medio líquido, el EEC, el EEF, el EA y el EC se evaporaron a presión reducida en rotoevaporador Büchi a 40ºC y se redisolvieron en el mismo volumen inicial con una solución de Triton X-1OO al 1% en agua (agente sulfactante), con el propósito de disolver nuevamente los compuestos presentes.
  
  
  

Para las mediciones realizadas a partir del EEC, el EEF, el EA y el EC, adicionalmente se utilizó una solución placebo de Triton X-1OO (1%), en la cual el porcentaje de mortalidad observado fue restado al obtenido a partir de los extractos ensayados correspondientes (el porcentaje de mortalidad en el placebo fue inferior al 3% a las 48 horas).

Análisis fitoquímico de los extractos. Para detectar los metabolitos secundarios en los extractos se empleó el tamizaje fitoquímico de Rondina y Cussio, descrito por Alfonso et al. (2000), y se investigó la presencia de: fenoles simples, taninos hidrolizables, taninos condensados (TC), fitoquinonas, aminoácidos no proteicos, triterpenos, esteroides, saponinas, cianógenos, cardenólidos, flavonoides, carotenoides, cumarinas, aceites esenciales y alcaloides. El fraccionamiento por polaridad, en el caso del EA, se realizó utilizando el tamizaje propuesto por MINSAP (2000) para la solución alcaloidal.

Se usaron patrones controles para comprobar el estado de los reactivos. En cuanto a la presencia o ausencia de los metabolitos, en el análisis cualitativo se utilizó el criterio propuesto por García (2003).
Clave de clasificación:
+ Presencia leve
++ Presencia notable
+++ Presencia cuantiosa

Obtención de larvas L₃. Para la obtención de las larvas infestantes se utilizó la técnica de los macrocultivos descrita por Soca et al. (2004), a partir de heces fecales de diez bovinos jóvenes, con altas cargas parasitarias, las cuales fueron mezcladas hasta obtener una pasta homogénea y depositadas en placas Petri, e incubadas a temperatura ambiente durante 10 días. Los cultivos tenían aproximadamente 240 larvas por mililitro.

Los estudios de cromatografía solo se les realizaron a los extractos acuosos, a través del proceso siguiente:
1. Adicionar Yb(AcO)₃ x 4H₂O con el objetivo de precipitar los compuestos fenólicos.
2. Centrifugar a 4 000 rpm.
3. Filtrar el precipitado en papel Watman No. 3.
4. Redisolver en solución de ácido oxálico (5%).
5. Adicionar HCl (5%) con calentamiento a 80^oC por 60 minutos; puntear la disolución preconcentrada con la ayuda de un capilar, en placas de 20 x 20 cm (Celulosa MN 300 platos) para uso bidimensional, utilizando como primer solvente en la dirección vertical por una hora una mezcla de AcOH glacial:H₂O (2:98), y como segundo solvente en la dirección horizontal por tres horas n-butanol:AcOH glacial:H₂O (100:15:25).

Los reactivos reveladores para la detección de las manchas cromatográficas fueron:
- Fenoles y/o polifenoles [FeCl₃/K₃(FeCN)₆/KMnO ₄].
- Flavonoides [Vainillina 10% en EtOH/HCl 12 M].
- Cumarinas [Reactivo de Baljet].

Se corrió en las mismas condiciones de las muestras un patrón (90 ml) que contenía 800 ppm de Quercetina, Rutina, Umbeliferona y Resveratrol.

· Aplicación de los extractos. En cada tratamiento la proporción fue de 0,50 mL de extracto por 1 mL de cultivo de larvas (500 como promedio). Se utilizó la técnica por enfrentamiento descrita por Molan et al. (2000) y Hoste (2002) para experimentos de actividad biológica in vitro.
Los conteos de larvas vivas y muertas se realizaron en dos partes, según la metodología descrita por Soca et al. (2004).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En este experimento los géneros de parásitos detectados en los cultivos de larvas fueron Trichostrongylus y Haemonchus; ambos se encuentran entre los géneros que infestan con mayor frecuencia los animales en los sistemas de explotación ganadera en el trópico (La O, Fonseca, Costa, Carrión, Vázquez, Liranza, Miranda, Sánchez, Pompa y García, 2003) y que también han sido reportados en los sistemas silvopastoriles y en investigaciones a nivel de laboratorio por Soca (2005).

En sentido general, los porcentajes de mortalidad se incrementaron bruscamente hasta los 30 minutos, seguidos por aumentos menos abruptos relacionados quizás con la posibilidad de que la concentración de los bioactivos en el medio acuoso haya disminuido considerablemente por oclusión o absorción en la larva. No obstante, deben realizarse estudios que tengan en cuenta la cuantificación de los metabolitos en el medio y el número de larvas por muestra, manteniendo fija la cantidad de extracto para llegar a conclusiones determinantes.

LA figura 1 muestra el comportamiento de la mortalidad de las larvas, de los géneros mencionados anteriormente, durante la primera hora de haber sido aplicado cada extracto a los cultivos. Los mayores índices de mortalidad correspondieron a los EAF y EAC, con valores superiores al 60% a los 30 minutos, los cuales llegaron a ser de 96 y 92% al pasar la primera hora, respectivamente.

Los EEC y EEF ocasionaron porcentajes de mortalidad intermedios (entre 20 y 35%), los cuales fueron similares a los 15 y los 60 minutos, sin diferencias significativas entre ambos. Por su parte, los EA y EC no causaron mortalidad ni disminución de la vitalidad larval antes de la primera hora.

Los primeros signos de disminución de la vitalidad de las larvas comenzaron desde que se agregaron los extractos acuosos (EAs); la disminución en la vitalidad en los extractos etanólicos (EEs) fue más lenta, debido quizás a que aunque los principios activos estuvieron presentes tanto en los EAs como en los EEs, se encontraban más diluidos por la presencia de otros compuestos que no presentaban una actividad acentuada. En este sentido, en los extractos crudos clásicamente se solubilizan la mayoría de los compuestos de poca polaridad, lo que trae consigo la interferencia en la actividad de las estructuras solubles en agua.

En los primeros 15 minutos los EAC y EAF mostraron índices de mortalidad superiores (70-85%) al resto de los extractos y similares entre sí. Este resultado evidencia que en el primer período de tiempo los componentes de mayor actividad comienzan a expresar su potencial helmíntico en el contacto directo con la membrana de las larvas.

Esta observación permite señalar que, en el caso particular de los metabolitos polares presentes en los EAs de M. alba, la acción antilarvicida está mediada por la naturaleza del compuesto activo y por los mecanismos de interacción de éste y la membrana de la larva.

Por otro lado, los metabolitos de mayor actividad son muy polares (como requisito previo), ya que si el peso molecular fuera demasiado grande, aunque fuera activo, la actividad biológica se hubiera expresado tardíamente, tomando como referencia la elevada constante dieléctrica que presenta el medio líquido en que se disuelven estos compuestos (Xiangrui y Hongsheng, 2001).

El EAF mostró numéricamente una mayor mortalidad que el EAC, ya que en la solución fraccionada se le habían extraído con anterioridad los compuestos solubles en cloroformo y éter de petróleo, los cuales no mostraron una actividad importante.

Desde el punto de vista práctico el resultado obtenido con el EAC tiene una gran importancia, ya que a escala productiva podría prepararse sin dificultad práctica que en los países africanos con pocos recursos (Tanzania, Nigeria y Etiopía) ha tomado gran auge en la pequeña y la mediana propiedad, principalmente, por los resultados empíricos y el déficit de fármacos sintéticos.

En ese sentido, las especies investigadas recientemente como control fitoquímico del parasitismo gastrointestinal han sido Acacia nilotica, Acacia karro, Albizia stipulata, Albizia antihelmintica (Githiori et al., 2003). Estas plantas leguminosas presentan considerables niveles de TC y la actividad antiparasitaria ha sido atribuida directamente a estos polifenoles. Por otra parte, en estudios in vitro e in vivo se ha podido demostrar la efectividad de los TC en la disminución de la vitalidad de las larvas L₃ (Molan et al., 2000) y la población de parásitos en el tracto gastrointestinal (Hoskin, 1998). Estos resultados presentan mayor importancia por la posibilidad que tienen los TC de no ser degradados cuantitativamente en el sistema digestivo de los rumiantes y los monogástricos.

No obstante, se ha demostrado que otras especies no leguminosas que carecen de TC o presentan bajas concentraciones, tales como Azadirachta indica (Meliaceae), Ananas comosus (Bromeliaceae), Vernonia anthelmintica (Asteraceae), Embelia ribes (Myrsinaceae), Fumaria parviflora (Fumariaceae) y Caesalpinia crista (Caesalpiniaceae), presentan propiedades helmínticas relacionadas con la presencia de otras estructuras activas (Hordegen, Hertzberg, Heilmann, Langhans y Maurer, 2003).

Al respecto la especie M. alba no contiene TC, pero exhibe una elevada diversidad de polifenoles hidrosolubles de peso molecular bajo, comparados con los TC (García, 2003).

En este sentido, Suck-Joon, Sang-Gil, Sang-Cheol, Boum-Young y Young-Joon (1997) también informaron que M. alba presenta actividad antinutricional y antilarvicida frente a especies de insectos de hábitat asiático, tales como Lymantria dispar, Acantholyda posticalis, Hyphantria spectabilis e Hyphantria. cunea.

En la figura 2 se muestra el comportamiento a partir de la segunda hora de exposición de los extractos; hubo una mortalidad superior al 97% para los EAs, entre 20 y 40% para los EEs, y entre 2 y 20% para los EA y EC; en los cuales, pasada la hora inicial, comenzaron a observarse las primeras larvas muertas.

Después de la primera hora no se observaron cambios sustanciales en los porcentajes de mortalidad en los EEs y EC, aunque el EA mostró ligeros aumentos (8%) después de la sexta hora, pero no difirió del EC, lo cual corrobora la baja actividad de los compuestos poco polares. Estos resultados indican que los metabolitos con acción larvicida en la morera se solubilizan preferentemente en solventes muy polares (agua), comparados con soluciones cuya polaridad es relativamente intermedia (etanol 70%).

Al analizar la tasa de mortalidad de las larvas por unidad de tiempo (fig. 3), se observó que el mayor índice de mortalidad periódica se encontró para los EAs a los 15 minutos después de su aplicación.

Asimismo, en la tabla 1 se muestra la presencia o ausencia de los metabolitos secundarios investigados en los extractos.

Los resultados indican la presencia de ocho grupos de metabolitos secundarios con solubilidades diversas; el resto de los metabolitos investigados estuvieron ausentes. Los fenoles simples estuvieron presentes en cinco extractos de los seis investigados y se encontraron en mayor cuantía en los EEs y EAs, debido a su elevada polaridad (Kim, Lee, Kim, Kim y Kim, 1998); en cambio los terpenoides solo se encontraron, de forma cuantiosa, en el EC y el EEC. Este resultado de solubilidad permite discriminar estos últimos compuestos como posibles causantes de la actividad helmíntica.

Los flavonoides estuvieron ampliamente distribuidos, al igual que las saponinas, las cumarinas y los alcaloides. Por su parte, los carotenoides solo se encontraron disueltos inicialmente en los solventes de extracción típicos (cloroformo, alcohol y éter de petróleo); mientras que los aceites esenciales solo estuvieron presentes en el EC, por lo que puede asegurarse la inefectividad de este grupo químico en la disminución de la viabilidad de las larvas. Ello difiere de los criterios farmacológicos clásicos descritos por San Martín y Girau (1956), acerca de que los terpenoides de estructuras sencillas presentan una elevada actividad ante los parásitos gastrointestinales.

Estos resultados se deben, probablemente, a la baja concentración de dichos metabolitos en la biomasa comestible (hojas y tallos tiernos) utilizada para este estudio, a las estructuras químicas particulares de los isoprenoides presentes o a que en el estadio larval (L₃) estos metabolitos, específicamente, no tengan un efecto acentuado.

Adicionalmente, en la tabla 2 se muestra la presencia relativa de los diferentes grupos de alcaloides en el EA. Independientemente de la gran diversidad de estructuras nitrogenadas que se detectaron, los alcaloides mayoritarios fueron los derivados de las sales cuaternarias (=N⁺-) y los que presentan el nitrógeno en forma oxidada (-N=O"!-N⁺-O^-) (extremadamente polares en soluciones acuosas), aspecto que coincide con lo informado por Xiangrui y Hongsheng (2001) en cuanto a la presencia de Deoxinojimicina en su forma metilada y su sal cuaternaria.

Por otra parte, la baja actividad larvicida del EA contrasta con los resultados sobre la potente acción biológica de estos metabolitos en parásitos gastrointestinales, tempranamente descrita por San Martín (1968). Esto pudiera estar relacionado con las estructuras particulares de los alcaloides que forman parte de M. alba, la concentración de éstos o su dilución intrínseca debido a la presencia de varios tipos de alcaloides que quizás hicieron antagonismo mutuo.

En la determinación de los compuestos mayoritarios mediante la cromatografía (tabla 3) se pudo apreciar que los polifenoles principales fueron los flavonoides (Quercetina y Rutina), las cumarinas (Umbeliferona) y los fenoles simples (Resveratrol). Estos resultados coinciden con los informados por García (2003) al evaluar diferentes variedades de M. alba, y apoyan lo planteado por Marles y Farnsworth (1995); Sun-Yeou, Jian-Jun y Hee-Kyoung (2000) y Hoo-Zoo y Won-Chu (2001) en cuanto a la presencia de fenilpropanoides en el género Morus, así como lo expresado por Feng, Kano y Xinsheng (1997) sobre la diversidad de derivados de estructuras estilbénicas en esta especie.

Además de las manchas correspondientes a los patrones ensayados con fines comparativos, también se pudieron observar otras marcas situadas en zonas específicas de la placa que describen la presencia de dos grupos adicionales de fenoles simples, un tercer tipo de flavonoide y una segunda cumarina.

La presencia de otros grupos de fenólidos en la especie también ha sido informada por Nam-Ho y Shi-Yong (1998), aunque en este trabajo no se pudo probar con exactitud qué tipo de fenoles adicionales estaban presentes, debido a la falta de otros patrones químicamente puros para realizar las comparaciones correspondientes.

Resulta interesante destacar que las larvas vivas encontradas en el EAC, después de las 48 horas de aplicado, correspondieron en su totalidad al género Haemonchus, lo que parece sugerir una mayor capacidad de estas a los metabolitos secundarios polifenólicos de la planta (fig. 4).

La elevada resistencia, versatilidad y amplia distribución de este género de parásitos en el trópico, ha sido señalada en investigaciones tanto con bovinos como con ovinos (Cuéllar, 2002; Achi, Zinsstag, Yao, Yeo, Dorchies y Jacquiet, 2003).

Esta capacidad para adaptarse a las más diversas zonas geoecológicas y a las condiciones climáticas más estresantes y adversas, está relacionada con sus características reproductivas, en especial su elevada prolificidad, ya que una hembra adulta, madura sexualmente, llega a ovopositar entre 5 000 y 10 000 huevos por día (Vázquez, 2000).

Por otra parte, varios autores, entre ellos Jackson (2002) y Waller (2003), señalan su elevada capacidad de resistencia genética al utilizar diferentes antihelmínticos de variados orígenes para el control de este género.

CONCLUSIONES

Los extractos de la especie M. alba var. Cubana presentan propiedades antihelmínticas frente a larvas L₃ de los géneros de parásitos gastrointestinales Trichostrongylus y Haemonchus en condiciones de laboratorio.

De los seis extractos obtenidos a partir de las hojas, pecíolos y tallos tiernos de la morera, los EAC y EAF son los de mayor acción antilarvicida, con una mortalidad superior al 80% a los 60 minutos.

La mayor actividad biológica de los extractos activos se expresa en los primeros 15 minutos y se debe a la presencia de polifenoles mayoritarios, tales como Quercetina, Rutina, Umbeliferona y Resveratrol.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Achi, Y.L.; Zinsstag, J.; Yao, K.; Yeo, N.; Dorchies, P. & Jacquiet, P. Host specificity of Haemonchus ssp. for domestic ruminants in the Savanna in northern Ivory Coast. Veterinary Parasitology. 116:151. 2003

2. Alfonso, M.; Fernández, L.; González, N. & Avilés, R. La Achira (Canna edulis Ker) y su potencialidad en el control de plagas. Ponencia XII Forum de Ciencia y Técnica. INIFAT. La Habana, Cuba. 11 p. 2000

3. Cuéllar, J.A. Agentes etiológicos de la nematodosis gastrointestinal en los diversos ecosistemas. En: Memorias, 2do. Curso Internacional "Epidemiología y control integrado de nemátodos gastrointestinales de importancia económica en pequeños rumiantes". (Eds. F.J. Torres & A.J. Aguilar). Yucatán, México. p. 1. 2002

4. Duke, J.A. Morus alba (L.). [en línea]. Disponible en: http://newcrop.hort.purdue. edu/newcrop/duke-energy[Consulta: Diciembre 2001]. 2001

5. Feng, Q.; Kano, Y. & Xinsheng, Y. Elucidation of the bioactive constituents in traditional Chinese medicine "Mori Cortex". Advances in plant glycosides, chemistry and biology. Proceedings of the International Symposium on Plant Glycosides. Kunming, China, p. 281. 1997

6. García, D.E. Evaluación de los principales factores que influyen en la composición fitoquímica de Morus alba (Linn.). Tesis presentada en opción al título de Máster en Pastos y Forrajes. EEPF "Indio Hatuey". Matanzas, Cuba. 97 p. 2003

7. Githiori, J.B.; Hoglund, J.; Waller, P.J. & Leyden, R. The anthelmintic efficacy of the plant Albizia anthelmintica against the nematode parasite Haemonchus contortus of sheep and Heligmosomoides polygyrus of mice. Veterinary Parasitology. 116:23. 2003

8. Hordegen, P.; Hertzberg, H.; Heilmann, J.; Langhans, W. & Maurer, V. The anthelmintic efficacy of five plant products against gastrointestinal thichostrongylids in artificially infected lambs. Veterinary Parasitology. 117:51. 2003

9. Hoskin, S.O. Internal parasitism and growth of farmed deer fed different forage species. Ph.D. Thesis , Massey University. Palmerston North, New Zealand. 90 p. 1998

10. Hoste, H. Importancia del óxido de cobre, plantas taníferas y taninos condensados en el control de nemátodos gastrointestinales en pequeños rumiantes. En: Memorias. 2do. Curso Internacional "Epidemiología y control integrado de nemátodos gastrointestinales de importancia económica en pequeños rumiantes". (Eds. F.J. Torres & A.J. Aguilar). Yucatán, México. p. 72. 2002

11. Ho-Zoo, L. & Won-Chu, L. Utilization of mulberry leaf as animal feed: feasibility in Korea. In: Mulberry for animal feeding in China. (Eds. Jian, L.; Yuyin, C.; Sánchez, M. & Xingmeng, L.). Hangzhou, China. 75 p. 2001

12. Jackson, F. Resistencia de antihelmínticos en ovinos y caprinos. En: Memorias, 2do. Curso Internacional "Epidemiología y control integrado de nemátodos gastrointestinales de importancia económica en pequeños rumiantes". (Eds. F.J. Torres & A.J. Aguilar). Yucatán, México. p. 68. 2002

13. Kim, S.Y.; Lee, W.C.; Kim, H.B.; Kim, A.J. & Kim, S.K. Antihy perlipidemic effects of methanol extracts from mulberry leaves in cholesterol-induced hyperlipidemia rats. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 27:1217. 1998

14. La O, M.; Fonseca, N.; Costa, P.J.; Carrión, Magdalena; Vázquez, J.; Liranza, Eglis; Miranda, M.; Sánchez, J.; Pompa, Marisbel & García, Amelia. Infestación por nemátodos gastrointestinales en un sistema de explotación caprina silvopastoril en condiciones de montaña. Pastos y Forrajes. 26:53. 2003

15. Marles, R.J. & Farnsworth, N.R. Antidiabetic plants and their active constituents. Phytomedicine. 2:137. 1995

16. Mendoza de Gives, P .Control alternativo de las helmintosis en rumiantes. Conferencia Electrónica. Red Latinoamericana de Helmintología. INTA-FAO, Argentina

17. MINSAP. 2000. Análisis fitoquímico preliminar para plantas medicinales. La Habana, Cuba. 7 p. (Mimeo). 2000

18. Molan, A.L.; Hoskin, S.O.; Barry, T.N. & Mc Nabb, W.C. Effect of condensed tannins extracted from four forages on the viability of the larvae of deer lungworms and gastrointestinal nematodes. Veterinary Records. 147:44. 2000

19. Nam-Ho, S. & Shi-Yong, R. Oxyresveratrol as the potent inhibitor on dopa oxidase activity of mushroom tyrosinase. Biochemical and Biophysical Research Communications. 243:801. 1998

20. Pietrosemoli, S.; Olavez, R.; Montilla, T. & Campos, Z. Empleo de hojas de Neem (Azadirachta indica A. Juss) en el control de nemátodos gastrointestinales de bovinos a pastoreo. Rev. Fac. Agron. (LUZ). 16 Supl 1:220. 1999

21. San Martín, R. Farmacognosia con farmacodinámica. Editorial Científico-Médica. Barcelona, España 1148 p. 1968

22. San Martín, R. & Girau, L. Farmacia mediterránea No. 1. Editorial Científico-Médica. Barcelona, España p. 4. 1956

23. Soca, Mildrey. Los nemátodos gastrointestinales de los bovinos jóvenes. Comportamiento en los sistemas silvopastoriles cubanos. Tesis presentada en opción al grado de Doctor en Ciencias Veterinarias. UNAH. La Habana, Cuba. 111 p. 2005

24. Soca, Mildrey; García, D.E. & González, M. Nota técnica: Efectividad del extracto acuoso de Morus alba en las larvas infectivas (L₃) de nemátodos gastrointestinales. Pastos y Forrajes. 27:279. 2004

25. Suck-Joon, P.; Sang-Gil, L.; Sang-Cheol, L; Boum-Young, L. & Young-Joon, A. Larvicidal and antifeeding activities of oriental medicinal plant extracts against four species of forest insect pest. Appl. Entomol. Zool. 32:601. 1997

26. Sun-Yeou, K.; Jian-Jun, G. & Hee-Kyoung, K. Two flavonoids from the leave of Morus alba induce differentiation of the human promyelocytic leukaemia (HL-60) cell line. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 23:451. 2000

27. Torres-Acosta, F. Utilizando la suplementación como una estrategia para el control de las nematodosis gastrointestinales en ovinos y caprinos. En: Memorias. 2do. Curso Internacional "Epidemiología y control integrado de nemátodos gastrointestinales de importancia económica en pequeños rumiantes". (Eds. F.J. Torres & A.J. Aguilar). Yucatán, México. p. 87. 2002

28. Vázquez, U.M. Agentes etiológicos y ciclos de vida de los nemátodos gastrointestinales. En: Memorias. 1er. Curso Internacional "Nuevas perspectivas en el diagnóstico y control de nemátodos gastrointestinales en pequeños rumiantes". (Eds. F.J. Torres, A.J. Aguilar & A. Ortega). Yucatán, México. p. 1. 2000

29. Vinent, N. Plantas antiparasitarias. ACPA. 2:16. 2003

30. Waller, P.J. Parasite epidemiology, resistance and the prospects for implementation of alternative control programs. In: Biological control of gastro-intestinal nematodes of ruminants using predacious fungi. Proceedings. FAO. Rome, Italy. p. 1. 1998

31. Waller, P.J. Global perspectives on nematode parasite control in ruminant livestock: the need to adopt alternatives to chemotherapy, with emphasis on biological control. Animal Health Research Reviews. 4 (1):35. 2003

32. Xiangrui, Z. & Hongsheng, L. Composition and medical value of mulberry leaves. In: Mulberry for animal feeding in China. (Eds. Jian, L.; Yuyin, C.; Sánchez, M. & Xingmeng, L.). Hangzhou, China. 75 p. 2001

Recibido el 5 de enero del 2005
Aceptado el 20 de junio del 2005