ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN

Los metabolitos secundarios de las especies vegetales

D.E. García
Estación Experimental de Pastos y Forrajes "Indio Hatuey"Central España Republicana, CP 44280, Matanzas, Cuba
E-mail: DGarcia@indio.atenas.inf.cu

INTRODUCCIÓN

El metabolismo secundario se puede definir como la biosíntesis, la transformación y la degradación de los compuestos endógenos mediante proteínas de especialización las cuales se han formado como resultado de los procesos de diferenciación y se clasifican según su significación biológica y función en la célula productora (Valdés y Balbín, 2000).

Según la definición en el marco ecológico propuesta por Stransburger, Noll, Schenk y Schimper (1994), estos compuestos son sustancias ecológicamente eficaces, frente a compuestos primarios que serían sustancias fisiológicamente eficaces. Los compuestos que derivan de este tipo de metabolismo se pueden clasificar de varias formas.

El ordenamiento estrictamente químico, basado en los principales grupos funcionales, es la forma más secuenciada de organización (Ikan, 1991). Desde el punto de vista de su incidencia negativa en la nutrición, se pueden clasificar según el tipo de metabolismo con quien interactúan (Delgado, 1998); los factores antinutricionales se definen como aquellas sustancias generadas por el metabolismo natural de las especies vegetales y que, por diferentes mecanismos, ejercen efectos contrarios a la nutrición óptima de los animales por la disminución del metabolismo digestivo (Ojeda, 1996).

La tabla 1 muestra la complejidad ascendente de las cadenas carbonadas, basado en el fraccionamiento estructural para el caso particular de los compuestos fenólicos (Harborne, 1990).

Para un mismo grupo funcional, además de la clasificación por las cadenas carbonadas presentes, la separación de los metabolitos secundarios también se realiza teniendo en cuenta la prioridad de organización de cada tipo de compuesto, la posición del grupo funcional, su configuración y la naturaleza de los residuos terminales (Thomsen, 1997).

Una de las principales diferencias que presentan los metabolitos secundarios con relación a los primarios es su distribución limitada en el reino vegetal; mientras que los compuestos primarios se encuentran en todo el reino y las diferencias entre especies solo son de índole cuantitativa (Ramos, Frutos, Giráldes y Mantecón, 1998).

Estos compuestos químicos se presentan típicamente en sólo una especie o un grupo de plantas taxonómicamente relacionadas (Grabiela-Anca, Dean y Wiley, 1997), por lo que muchos de ellos se consideran marcadores taxonómicos de familias y géneros (Garbarino, 2003).
Los metabolitos secundarios se encuentran principalmente en las plantas, pero cada estructura básica varía considerablemente acorde con el Phylum.

La tabla 2 muestra la distribución de los principales compuestos fenólicos en el reino vegetal.

Los compuestos fenólicos no son comunes en las bacterias, los hongos y las algas, donde as clases de esqueletos hidroxilados son escasos, comparados con el resto de las plantas (Harborne, 1990); los flavonoides también están casi ausentes; sin embargo, los derivados clorinados solamente son producidos por el hongo

Los hongos y las algas no sintetizan fenoles en asociación simbiótica; los líquenes producen especialmente sustancias fenólicas, las que pueden ser coloreadas; estos organismos se caracterizan por tener dépsidos o depsidonas, pero pueden ser sintetizadas otras clases de mayor distribución como las Xantonas y Antraquinonas (Markham, 1988).

En las plantas vasculares se encuentra la mayor cantidad de polifenoles (Kumar, 1992); los helechos, Gymnospermas y Angiospermas contienen ligninas en la pared celular. Los Ácidos hidroxibenzóico e hidroxicinámico, además de en los flavonoides, están universalmente presentes en todas las plantas. Otras clases tienen una distribución más discreta, como el caso de los isoflavonoides, ampliamente reportados en la familia Leguminosae (Keh-Feng y Yuh-Fang, 1996); mientras que las Antraquinonas (comunes en seis familias botánicas) y las Xantonas abundan en Gentianaceae, Guttiferae, Moraceae y Polygalaceae (Harborne, 1990).

Por otra parte, en cada planta las yemas en crecimiento, las hojas jóvenes, los órganos reproductores y de dispersión, y en general todas las partes en crecimiento anual, muestran una mayor concentración, reactividad y diversidad de metabolitos secundarios (Makkar, Dawra y Singh, 1991).

Desde el punto de vista ultraestructural, los metabolitos secundarios se encuentran principalmente en las vacuolas, la periferia adyacente interna o el centro de los orgánulos citoplasmáticos (Lees, Suttill y Gruber, 1993), además de que sus concentraciones se diferencian en las distintas partes de la planta (Harborne,1990).

Desde el punto de vista botánico, las plantas rastreras contienen menores concentraciones de metabolitos secundarios que las plantas arbóreas. Esta diferenciación se ha hecho evidente en las especies de la familia Leguminosae (García, 2003).

El término secundario implicaba, al principio de las investigaciones, que estas sustancias tenían una menor importancia y muchas veces se les atribuyó la propiedad de productos de desecho del metabolismo primario. Esta idea ha sido gradualmente cambiada, ya que los compuestos secundarios desempeñan un papel protagónico en la fisiología de la planta, la regulación del crecimiento, su desarrollo y la interacción con otros organismos (Raskin, 1992), por lo que a partir de 1960 se han realizado investigaciones que han hecho evidente la importante función ecológica de muchos de ellos (Valdés y Balbín, 2000).

Cada tipo de compuesto secundario está estrechamente relacionado con una o varias funciones específicas en la planta que lo contiene.
Son innumerables los reportes que describen el papel que desempeñan estos compuestos en el reino vegetal, aunque hasta la fecha, en la mayoría de ellos, no se conoce con exactitud cada función particular.

En algunos casos intervienen en las relaciones de competencia con otras plantas, actuando como agentes alelopáticos y contra invasiones de hongos, bacterias y virus (Harborne, 1993); en relaciones de mutualismo en la atracción de polinizadores y dispersores de semillas (Ramos et al., 1998); en funciones defensivas causando toxicidad (Foo, Lu, Mc Nabb, Waghorn y Ulyatt, 1997);Uno de los metabolitos secundarios mejor estudiados en cuanto a su distribución natural y función es el Ácido salicílico (Raskin, 1992). Este fenol simple está presente en las estructuras reproductivas y las hojas de 34 importantes especies botánicas empleadas en la agricultura, lo que confirma su distribución extensiva (Raskin, Skubatz, Tang y Meeuse, 1990). Este ácido induce la floración, participa en la regulación del potencial de las membranas celulares y la resistencia de enfermedades, induce cambios de temperatura en las plantas termogénicas, interviene en la expresión de algunos genes y actúa como atrayente de parásitos del género Striga.

Las rutas biosintéticas que forman parte del metabolismo secundario es un tema que en los últimos años ha llamado poderosamente la atención. La síntesis específica de cada compuesto suele estar restringida a estados específicos del desarrollo respectivo de cada tipo de organismo, células especializadas y períodos de estrés causados por la deficiencia de nutrientes o por el ataque de microorganismos. Este fenómeno se debe a la formación, dependiente de fase, de la correspondiente enzima, lo que significa que la expresión del metabolismo secundario se basa en un proceso de diferenciación (Azcón-Bieto y Talón, 2000).

Muchos factores afectan la síntesis de los metabolitos secundarios; la concentración de CHS, el estado acuífero y la temperatura ambiental son algunos de los más importantes. Atendiendo a las vías biosintéticas que les dan origen, los compuestos secundarios se dividen en tres grandes grupos: los terpenos, las sustancias fenólicas y los compuestos que contienen nitrógeno en su estructura (Valdés y Balbín, 2000).

El metabolismo primario proporciona un gran número de moléculas simples, como el ácido shiquímico, el acetato y los aminoácidos, los cuales constituyen los materiales de partida para las rutas biosintéticas del metabolismo secundario.

El ácido shiquímico, por la ruta metabólica que lleva su nombre, da origen a muchos compuestos aromáticos, entre ellos los aminoácidos, los ácidos cinámicos y algunas estructuras polifenólicas. El acetato es el precursor de los ácidos grasos y de los policétidos en la ruta del acetato-malonato, y los terpenos o isoprenoides son sintetizados en la ruta del acetato-mevalonato. Los aminoácidos son precursores de los alcaloides y de los antibióticos peptídicos.

Todos los terpenos naturales proceden de unidades de acetato activo (acetil-CoenzimaA), que se condensan y transforman para originar ácido mevalónico, unidad de cinco átomos de carbono, específica de la biosíntesis de terpenos.
La figura 1 describe la interconexión de los principales grupos de metabolitos secundarios y su relación con la fotosíntesis.

La biosíntesis de las estructuras fenólicas se efectúa por dos rutas metabólicas esenciales: la del ácido shiquímico y la del ácido malónico (conocida como la de los policétidos); la primera es mayoritaria en las plantas superiores y la segunda es favorecida en los microorganismos. La fenilalanina y la tirosina son intermediarios metabólicos en la biosíntesis de numerosos compuestos fenólicos, y el triptófano es el precursor de hormonas como el ácido indolacético.

Los alcaloides se forman por rutas biosintéticas muy diversas, a partir de muchos aminoácidos como la L-arginina, la L-lisina, la L-fenilalanina, L-triptófano y otros. Ocasionalmente derivan de la L-prolina, el ácido antranílico (precursor y producto de degradación del L-triptófano), el ácido nicotínico (formado a partir del ácido aspártico), raras veces del L-triptófano, restos de isopentenilo, isopentenil pirofosfato, acetilo proveniente del acetil-CoenzimaA y de grupos metilo de S-adenosilmetionina.

Según Valdés y Balbín (2000), en la biosíntesis de los alcaloides se han reconocido tres tipos generales de reacción que determinan su estructura principal: la acción de Mannich y el acoplamiento oxidativo de fenoles.

Métodos de cuantificación

Existen numerosos métodos para cuantificar los contenidos de metabolitos secundarios de interés en la nutrición animal. No obstante, cada técnica analítica presenta limitaciones intrínsecas, por lo que no son aplicables de manera general en todos los casos.
Las diferentes coloraciones y la cantidad de color producidas por unidad de masa en los métodos colorimétricos (Schofield, Mbugua y Pell, 2001), la variabilidad en los resultados con la utilización de diferentes patrones y los diferentes mecanismos en las técnicas de precipitación (Krueger, Carter Dopke, Treichel, Folts y Reed, 2000), son las mayores limitantes en las marchas analíticas más utilizadas en la actualidad.
El grupo de metabolitos que más se ha cuantificado en el campo de la nutrición animal son los compuestos fenólicos, como producto de su amplia distribución en las plantas de interés agrícola y su repercusión en la fisiología digestiva de los rumiantes y los monogástricos (Mueller-Harvey, 2001).

Los métodos colorimétricos de Folin-Dennis y Folin-Ciocalteau (propuestos en los trabajos realizados por estos autores entre los años 1912 y 1927), que se basan en la reducción del ácido fosfomolíbdico hasta óxidos azules de molibdeno con estados de oxidación inferiores a 7, se han convertido en técnicas universales en la determinación de fenoles totales (Singleton, Orthofer y Lamuela-Raventós, 1999; Mueller-Harvey, 2001); sin embargo, Schofield et al. (2001) plantean que el método del Azul de Prusia (FeCl3/ K3Fe(CN)6), en sentido general, propicia mejores lecturas.

Con el desarrollo vertiginoso de la química analítica ha sido validado un gran grupo de procedimientos modernos, que abarcan desde las más simples técnicas hasta la utilización de los instrumentos más sofisticados (Harborne, 1998; Makkar, 1999).
Según la recopilación realizada por Schofield et al. (2001), los métodos para la cuantificación de compuestos fenólicos se pueden clasificar en: 1) colorimétricos, 2) cromatográficos, 3) gravimétricos, 4) de inhibición enzimática, 5) por precipitación, 6) toxicológicos.
Las lecturas mediante el desarrollo de color son las más empleadas mundialmente, porque requieren menor complejidad de instrumentos y son más accesibles.

El ensayo del Butanol-HCl es específico para taninos condensados, pero requiere de patrones internos fidedignos a la naturaleza de la muestra analizada, ya que el color varía con la estructura tánica. Aunque es un método clásico, no es totalmente confiable para la determinación si no se conoce el tipo de tanino presente (Dallzell y Kerven, 1998).

La utilización de la Vainillina-HCl es específica para meta difenoles y se pueden cuantificar los monómeros de taninos condensados obtenidos después de la hidrólisis del material; no obstante, si están presentes unidades de flavonoides se pueden obtener sobreestimaciones de los contenidos de estos tipos de taninos (Sun, Ricardo da Silva y Spranger, 1998).El método de azul de Prusia es muy utilizado por presentar buena correlación con la actividad biológica. Aunque mediante este reactivo reaccionan todos los fenoles, las transformaciones dependen mucho de las condiciones del análisis y pueden interferir otros agentes reductores. Las cuantificaciones de diferentes estructuras hidroxiladas mediante el procedimiento de biólisis y el empleo de floroglucinol, requieren de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y son excelentes para determinaciones estructurales.

Mediante la tiólisis se requieren taninos puros y con la utilización de floroglucinol los rendimientos tienden a disminuir, además de que los bencil mercantanos formados presentan olores desagradables y las rupturas de los enlaces, en algunos casos, no son cuantitativas (Schofield et al., 2001).

La utilización de iterbio trivalente (Yb3+) como agente precipitante de fenoles no requiere de patrones, pero los rendimientos pueden variar con la relación Yb/fenol, además de que la muestra necesita ser incinerada (Mueller-Harvey, 2001).
Los ensayos enzimáticos precisan de manera adicional otras técnicas biológicas y la susceptibilidad de la enzima puede ser variable (Adams y Harbertson, 1999), por lo que estas técnicas por sí solas no permiten llegar a conclusiones sólidas (Hagerman, 1998; Fickel, Pitra, Joest y Hofmann, 1999).

Los procedimientos de precipitación con proteínas reflejan una importante repercusión biológica, pero los resultados son diferentes en dependencia de la proteína seleccionada para el análisis (Hagerman, Zhao y Jonson, 1997).

El empleo de polietilenglicol (PEG) para la obtención de resultados totalmente concluyentes requiere de carbono marcado (14C-PEG).
Los procedimientos que emplean HPLC son factibles para las determinaciones de estructuras complejas (Hedqvist, Mueller-Harvey, Reed, Krueger y Murphy, 2000), pero algunos solo son aplicables para taninos condensados de 7 a 8 unidades, y en ocasiones se observan uniones irreversibles con la matriz utilizada (Lazarus, Adamson, Hammerstone y Schmitz, 1999; Hammerstone, Lazarus, Mitchell, Rucker y Schmitz, 1999; Labarbe, Cheynier, Broussard, Bouguet y Moutounet, 1999).

Las pruebas de inhibición del crecimiento microbiano constituyen uno de los mejores ensayos biológicos en la actualidad, aunque la selección de la bacteria y el medio de cultivo pueden afectar los resultados. Por otra parte, se requiere de niveles relativamente elevados de polifenoles porque se presentan inconvenientes relacionados con la competencia del agente enlazante (Nelson, Pell, Doane, Giner-Chávez y Schofield, 1997).

Otros métodos significativamente importantes son el empleo de la rodanina para la cuantificación de taninos hidrolizables del tipo galotaninos (Mueller-Harvey, 2001), el empleo de KIO3 en las determinaciones de galo y elagitaninos (Willis y Allen, 1998), las determinaciones de peso molecular (Guyot, Doco, Bouguet, Moutounet y Driliau, 1997) y el apoyo que propicia la cromatografía de fase normal (Cheynier, Bouguet, Le Roux, Guyot y Rigaud, 1999) y de fase reversa en las separaciones cuantitativas de las diferentes especies fenólicas (Waterhouse, Price y McCord, 1999).

Los procedimientos analíticos más factibles para la determinación de cumarinas y flavonoides se basan en las propiedades estructurales de estos compuestos de tener patrones conformacionales rígidos, que les permiten una absorción muy intensa en el espectro ultravioleta, después de separaciones y fraccionamientos previos que evitan un gran número de interferencias analíticas (Mochiutti, 1995; Méndez, 1996 Gutiérrez, Miranda, Varona y Rodríguez, 2000); no obstante, se debe conocer aproximadamente las estructuras que se cuantificarán con vistas a realizar una óptima selección del patrón en el análisis (Mueller-Harvey, 2001).

Otros metabolitos secundarios, como los triterpenos y esteroles, se determinan fundamentalmente por diversos métodos cromatográficos (AOAC, 1990) o mediante la extensión de la prueba cualitativa de Liebermam y Buchard, basado en la formación de compuestos coloreados, como producto de la reacción en medio ácido del anhídrido acético con el doble enlace presente en los anillos B y C de los esteroides y triterpenos, respectivamente; estas instauraciones resultan típicas en ambas agrupaciones (Galindo, Rosales, Murgueitio y Larrahondo, 1989).

Efecto en los sistemas biológicos

A lo largo de la evolución, la refinada especialización del metabolismo secundario ha constituido una de las adaptaciones más sorprendentes en las plantas superiores, con el objetivo de lograr mantener el equilibrio interespecífico en la naturaleza.
El propósito fundamental de esta diferenciación enzimática estuvo encaminado, en primer lugar, a que estos compuestos cumplieran funciones específicas en el metabolismo vegetal, además de actuar como defensas importantes frente a los herbívoros, por la imposibilidad de huir ante estos (Harborne, 1993; Cheecke, 1995; Ramos et al., 1998).

Es evidente que la amplia diversidad de estructuras generadas por estas proteínas especializadas produce efectos extremadamente diversos en la biología de los organismos vivos. Indistintamente, en la literatura se reportan efectos negativos relacionados con problemas de toxicidad en los insectos herbívoros, las aves, los pequeños mamíferos, los cerdos, los rumiantes y el hombre (Mueller-Harvey y Mc Allan, 1992);así como efectos beneficiosos en la producción industrial de fármacos (Mateos, 2003), la terapia contra el cáncer y la biotecnología (Anon, 2003a), en la domesticación y la diversificación de las plantas de interés agrícola (Anon, 2003b), en los estudios biológicos y moleculares (Torpoco y Garbarino, 2003) y en las ciencias médicas (Anon, 2003c). Otro efecto polémico es la acción defaunante que causan en la microbiología ruminal (Galindo, Castillo, Aldama, Marrero, García y Martínez, 1998; Colectivo de autores, 2003).

La concentración de los metabolitos secundarios en el tejido vegetal es uno de los principales elementos que diferencian la acción positiva o detrimental en la nutrición animal (Aerts, Barry, Warren y Mc Nabb, 1999), aunque la variabilidad estructural dentro de un mismo grupo funcional, la isomería de posición y los alargamientos de los radicales carbonados, también diferencian la accción particular de cada compuesto en los diferentes animales (Baker, Medlock y Sheehan, 1998; Cassidy, Hanley y Lamuela- Raventós, 2000).

En el campo de la nutrición animal a nivel mundial, los taninos condensados han sido el grupo de compuestos mejor estudiados en cuanto a su repercusión fisiológica y su amplia distribución (Wolfgang y Shelton, 1995; Ben Salem, Nefzaoui, Ben Salem y Tisserand, 1999a, 1999b; Ben Salem, Nefzaoui, Ben Salem y Tisserand, 2000); otros metabolitos inhiben la digestión, al afectar la actividad catalítica de algunas enzimas (Delgado, 1998), y pueden restringir la absorción de los alimentos (Liener, 1997).

De las 1 200 clases de compuestos secundarios que contienen las plantas (Kumar, 1992) no todos se encuentran bien estudiados, debido a su elevada diversidad; algunos grupos como los triterpenoides, las cumarinas, las anticarbohidratasas, las tioxalidonas, los tiocianatos e isotiocianatos, las antibiotinas y las sustancias que aumentan de forma particular las pérdidas catabólicas, han recibido tratamientos más discretos en cuanto a su repercusión en el campo de la fisiología y la nutrición (Midjavila, 1990).

No obstante, existen algunas funciones químicas, como los glucósidos cianogénicos y alcaloides (Sotelo, Contrera y Flores, 1995; Sotelo, Sousa y Sánchez, 1995), así como las fitohemoaglutininas (Le Guen y Birk, 1993; Goodbole, Krishna y Brata, 1994), que se han investigado con mayor sistematicidad.
A modo de resumen, en la tabla 3 se presentan algunos de los disímiles efectos que causan los metabolitos secundarios en los sistemas biológicos.

CONCLUSIONES

El metabolismo secundario constituye una de las adaptaciones más sorprendentes en el reino vegetal y para su diferenciación las especies de plantas superiores han necesitado miles de años de evolución continua y perfeccionamiento, a través de la interacción con el medio ambiente circundante y las relaciones ínterespecíficas. A medida que la ciencia se ha desarrollado progresivamente, el hombre ha empleado con fines prácticos diversos los compuestos secundarios que derivan de estas rutas biosintéticas para su bienestar y mejoramiento. Estas estructuras pueden ocasionar efectos detrimentales o beneficiosos en la alimentación animal, fundamentalmente en dependencia de la concentración y la naturaleza del compuesto especfico. El conocimiento de este tema de la bioquímica vegetal por los profesionales de las ciencias agropecuarias, específicamente los que investigan en la nutrición animal, ayudará a realizar un uso más eficaz de los recursos forrajeros y los dotará de una visión sólida en el campo de la alimentación integrada y de la bioquímica de las plantas, con el fin de incrementar la producción ganadera actual basada en esta fuente de alimento.

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Recibido el 21 de octubre del 2003
Aceptado el 3 de diciembre del 2003