ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN

Aspectos fisiológicos y genotípicos en rizobios aislados de leguminosas forrajeras

C. J. Bécquer¹, Danielle Prévost² y J. Cloutier^2
1 Estación Experimental de Pastos y Forrajes Sancti Spiritus Apdo. 2228, Zona Postal 1, Sancti Spiritus, Cuba
²Agriculture and Agri-Food Canada, Crops and Soil Research and Development Center, Sainte-Foy, Québec, Canada

RESUMEN

Se estudiaron las características fenotípicas y genotípicas de 23 cepas de rizobios aisladas de leguminosas forrajeras nativas de la zona sur de Sancti Spiritus, con el fin de conocer aspectos relacionados con su fisiología y diversidad genética. Para ello se colectaron nódulos radiculares, se aislaron las cepas y se efectuaron evaluaciones fisiológico-bioquímicas en relación con el crecimiento, la morfología y la tolerancia a factores abióticos extremos. Para la evaluación del genotipo se realizó la amplificación de las regiones IGS del ADN ribosómico 16S y 23S. Mediante estas pruebas se demostró que las cepas son cercanas genética y fisiológicamente a Bradyrhizobium sp. y se revelaron caracteres fisiológicos no reportados para este género. Asimismo, se comprobó la existencia de cinco grupos de cepas en la amplificación de las regiones IGS del ADN r 16S y 23S.

Palabras clave: Bradyrhizobium, fenotipos, genotipos.

ABSTRACT

Phenotypic, as well as genotypic characteristics of 23 rhizobial strains, isolated from forage legume species located in the southern zone of Sancti Spiritus, were studied with the aim of broading knowledge on its physiology and genetic diversity. For this purpose, collection of nodules, isolation of strains and several physiological/biochemical evaluations regarding growth, morphology and tolerance to extreme abiotic factors were performed. For genotypic evaluation, the PCR-RFLP analysis of 16S-23S rDNA IGS regions was carried out. It was demonstrated that strains were genetically and physiologically close to Bradyrhizobium sp. and physiological traits non common for this genus were showed. In other hand, 5 groups of strains from the PCR-RFLP of IGS regions were detected.

Key words: Bradyrhizobium, phenotype, genotype.

INTRODUCCIÓN

La provincia Sancti Spiritus se caracteriza por una amplia gama de géneros y especies de leguminosas diseminadas por sus cuatro zonas edafoclimáticas (Hernández, 1989), donde se les puede localizar en áreas con características ambientales estresantes, tanto para las plantas como para los microorganismos.
Las leguminosas nativas o naturalizadas, además de aportar material nutritivo de alta calidad biológica para la alimentación del ganado, constituyen una fuente potencial de poblaciones nativas de rizobios. Estos, debido a su gran diversidad, pueden proveer de cepas de alta efectividad y competitividad para la inoculación de leguminosas promisorias en el trópico (Neves y Rumjanek, 1997).
Los métodos de caracterización de las cepas se basan en evaluaciones del fenotipo y del genotipo, tales como: análisis numérico de las características de las colonias y cultivos, así como análisis de la homología ADN-ADN y del ARN 16S ribosómico (Graham, Sadowsky, Keyser, Barnet, Bradley, Cooper, Ley, Jarvis, Roslycky, Strijdom y Young, 1991). Su nivel de resolución varía considerablemente, por lo que se impone escoger aquellos que complementen las del fenotipo y sean lo más específicos posible en el genotipo.
Este trabajo tuvo como objetivo la caracterización fisiológica y genética preli-minar de cepas de rizobios aislados de leguminosas nativas en ecosistemas de la provincia Sancti Spiritus, así como la búsqueda de caracteres fisiológicos con futuras aplicaciones en la práctica agrícola.

MATERIALES Y MÉTODOS

Características del suelo
Se tomaron muestras de suelo y se determinaron sus propiedades químicas en el Laboratorio de Análisis Químico de la Estación Experimental de Suelos y Fertilizantes Barajagua, provincia de Cienfuegos. Se determinó el pH, la capacidad de cambio catiónico, la relación Ca/Mg, el P₂O₅, el K₂O y la materia orgánica.

Datos climáticos durante el período de prospección
Los datos de precipitaciones, temperatura y humedad relativa se tomaron del archivo de datos climáticos del Instituto de Meteorología (Sancti Spiritus), perteneciente al Ministerio de Ciencia, Tecnología y Medio Ambiente (CITMA).

Colecta de nódulos
Se realizó una prospección según la metodología de Hernández y Hernández, modificada por Alvarez, Martínez, Vega, Cancio, Bécquer, Funes-Monzote y Alvarez (1997), en las proximidades del poblado San Pedro, municipio Trinidad, el cual se caracteriza por su escasa vegetación y humedad y por presentar pastos ralos. Se seleccionaron plantas vigorosas, en el estadio fenológico de inicio de floración, sin indicios de ataque de plagas o presencia de enfermedades.

Aislamiento de los rizobios
Los rizobios fueron aislados por el método de Date (1982). Los nódulos, anteriormente a su manipulación, fueron rehidratados en agua corriente durante 3 h. El Rojo Congo se añadió a razón de 10,0 mL/L (pH 7). La conservación posterior de las cepas aisladas se efectuó en tubos de ensayo que contenían un medio levadura-manitolagar (LMA) (MgSO₄: 0,2 g/L, K₂HPO₄: 0,5 g/L, NaCl: 0,2 g/L, extracto de levadura: 1,5 g/L, manitol: 10,0 g/L, agar: 15,0 g/L y FeCl₃ 1%: 1,00 ml/L) en forma de cuña, a una temperatura de 4ºC (Somasegaran y Hoben, 1994).

Identificación de los rizobios
· Método de infección de plántulas in vitro de Macroptilium atropurpureum
La identidad de los rizobios se confirmó por su capacidad de producir nódulos en M. atropurpureum (Somasegaran y Hoben, 1994), mediante la utilización de tubos de ensayo de 150 x 25 cm que contenían solución nutritiva agarizada de Norris y Date (Date, 1982): KCl: 0,001 M; K₂HPO₄: 0,001 M; MgSO_4.H₂O: 0,001 M; CaSO₄: 0,002 M; Cu: 0,01 ppm; Zn: 0,025 ppm; Mn: 0,025 ppm; Mo: 0,0125 ppm y Fe: 0,3 ppm. Las plántulas crecieron en una cámara de condiciones controladas SIOH (Conviron Co., Canadá), con una periodicidad luminosa de 16 horas luz (300 microeinsteins m^-2 s^-1) a 26ºC durante el día y 22ºC durante la noche; la humedad relativa fue de 75/85 %. La nodulación de las plantas se observó después de 4 semanas de crecimiento.

· Tinción de Gram
Se comprobó la reacción de la pared celular a la tinción de Gram con la adición de solución cristal violeta, solución de yodo, alcohol yodado y colorante de contraste a un frotis seco de las cepas (Graham y Parker, 1964).

· Crecimiento en Peptona-Glucosa-Agar (PGA)
Sobre la base de la metodología de Somasegaran y Hoben (1994) se comprobó el crecimiento de las cepas en un medio PGA (peptona: 10,0 g/L, glucosa: 5,0 g/L, agar: 15,0 g/L, púrpura de bromocresol 1,0 % en etanol: 10,0 mL/L, pH: 6,7).

Evaluaciones del fenotipo
· Tolerancia a los factores abióticos
Se evaluó la habilidad de las cepas para crecer en medio caldo-levadura-manitol (CLM) bajo distintos niveles de pH (4; 4,5; 5; 8; 9; 10; 11 y 12) y temperatura (5; 35; 37; 38; 40 y 41ºC), así como diferentes niveles de NaCl (0,3; 0,5; 0,6; 0,7; 1 y 2 %) (Drouin, Prévost y Antoun, 1996). Para ello se confeccionaron inóculos con un título de 10⁸ cél./mL, en tubos de ensayo que se colocaron en una zaranda orbital Rotatest (Francia) a 200 rpm durante 20 días.

Evaluaciones del genotipo
· Análisis de la amplificación de las regiones del IGS (InterGenomic Spacer) del ADN ribosómico 16S y 23S
- Cepas de referencia utilizadas. Se utilizaron las cepas Bradyrhizobium sp. 25B6 (Centrosema pubescens) y Bradyrhizobium sp. 61B7 (Glycine javanica) ambas aisladas en Australia; Bradyrhizobium sp. LMG 9980 y 9966, B. japonicum USDA 110 y ATCC 10324, así como Bradyrhizobium sp. MSDJ 718.
- Patrón de peso molecular. Se utilizó el STd VIII (Boehringer Mannheim) de 1 114 pb.
- Cepas nativas utilizadas. Se utilizaron todas las cepas de la zona edafoclimática escogida (zona sur de Sancti Spiritus).
- Digestión con proteinasa K. Se cultivaron las cepas en TL hasta una D.O. de 2 a 620 nm. Se centrifugó a 13 000 rpm en una centrífuga Rotatest (Francia). Después de desechar el sobrenadante, se añadió 100 mL de H₂O nanopura estéril y 100 mL de tri-HCl (tris-hidroximetil amino-metano) a 10 mM y pH 8,2. Posteriormente se añadió 13 mL de proteinasa K y se colo-caron los tubos durante 2 h a 55ºC y por 10 min en agua hirviendo para desnaturalizar la proteinasa K. Se conservaron las muestras a -20ºC.
- Amplificación de las regiones IGS por PCR. Se utilizaron los primers FGPS 1490 y FGPS 132 (Laguerre, Mavingui, Allard, Charney, Louvrier, Mazurier, Rigottier-Gois y Amarger, 1996). La amplificación del ADN se realizó en un TRIO-Thermoblock Biometra TB1 (Alemania) con el siguiente perfil de temperatura: una desnaturali-zación inicial a 95ºC por 3 min, 35 ciclos de desnaturalización (1 min a 94ºC), recoc-ción (1 min a 55ºC) y extensión (2 min a 72ºC), y una extensión final a 72ºC por 3 min. La amplificación se comprobó por electroforesis.
- Análisis de los fragmentos de restricción. Fueron digeridas alícuotas de 8,0 mL de los productos del PCR con la endonucleasa de restricción HaeIII. Las muestras se colocaron en incubación a 37ºC toda la noche para su digestión. El ADN restringido se analizó mediante electro-foresis horizontal en 4 % de Agarosa NuSieve 3:1 (Rockland, Maine). La electroforesis se realizó a 80 V durante 4 h con geles de 11 x 14 cm, que se tiñeron en una solución acuosa de bromuro de etidio (1,0 mg/mL) y se fotografiaron bajo iluminación UV con un film Polaroid tipo 665 (USA).

RESULTADOS

Características químicas del suelo
El suelo se identificó como Ferralítico Amarillo cuarcítico lixiviado (Anon, 1975), con pH ácido y contenidos de MO, P₂O₅ y K₂O característicos para este tipo de suelo. El fósforo presentó valores extremadamente bajos (tabla 1) y se detectó una concentración de 0,18 % de NaCl.
Características del clima
En el período de prospección de los nódulos, en Trinidad (zona sur) hubo una temperatura de 28,7ºC; 92,5 mm de precipitación y 80 % de humedad.

Colecta de nódulos
La nodulación en las raíces de las especies colectadas se caracterizó por ser escasa; los nódulos fueron de tamaño mediano o pequeño, de color rosado y mayormente localizados en las raíces secundarias. La vegetación acompañante estuvo formada por pastizales.

· Infección de plántulas in vitro de M. atropurpureum
Las plántulas pertenecientes al tratamiento inoculado presentaron nodulación radicular. Todas las cepas mostraron respuesta negativa a la tinción de Gram y se observaron bacilos no esporulados, así como bacteroides en el frotis. No se observó crecimiento notable en medio PGA que indicara la presencia de otros microorganismos.

Caracterización fenotípica

· Morfología y tasa de crecimiento
Las cepas, en general, mostraron colonias convexas de bordes regulares (algunas punctiformes), de color lechoso y consistencia gelatinosa, varias de ellas con abundante goma.
Las colonias de las cepas aparecieron a los 3-5 días, con diferentes diámetros (de menos de 0,1 mm a 0,2 mm) y algunas con abundante goma, todas productoras de ácido, excepto una (C. virginianum) sin reacción aparente y cuatro con absorción de Rojo Congo: tres cepas de C. virginianum y una de Stylosanthes viscosa (tabla 2).

· Tolerancia a los factores abióticos
Las cepas de la zona sur toleraron temperaturas extremas de 40ºC (aisladas de C. pubescens), pH 11 (aisladas de C. virginianum y S. viscosa) y 0,6 % de NaCl (aislada de S. viscosa); en menor grado le siguieron cepas de C. virginianum y del resto de las leguminosas en cuanto a la tolerancia a estas variables (tabla 3).

Caracterización genotípica
· Análisis de la amplificación de las regiones IGS del ADN ribosómico 16S y 23S
Las regiones del IGS del ADN 16S y 23S ribosómicos de las 23 cepas nativas fueron amplificadas con los primers FGPS 1490 y FGPL 132 `. Los patrones de restricción, con la digestión de la endonucleasa HaeIII, se compararon con los de referencia (fig. 1a), lo que permitió agrupar las
cepas (Tabla 4). Se observó la formación de cinco grupos, donde tres de las cepas de referencia se situaron en los grupos I y IV.

Los patrones de banda obtenidos del PCR variaron en los grupos de cepas nativas (fig. 1b). La mayoría de las cepas mostraron tres bandas en un rango de 692 a 67 pb (cepas SP_1-5, _{8, 9, 12-15}), mientras que otras alcanzaron hasta 110 pb (SP₁₈, _20-23). La cepa SP₁₀ mostró una banda adicional en el mismo rango de peso molecular y una tercera banda en 67 pb. SP_{6, 7} y SP₁₁ mostraron dobles bandas en un amplio rango de 692 a 190 pb

DISCUSIÓN

Los análisis de suelo mostraron un pH ácido (4,4), escasa materia orgánica y muy bajo contenido de P₂O₅ y K₂O, características típicas de los suelos Ferralíticos Amarillos cuarcíticos lixiviados (Anon, 1975). La nodulación de las leguminosas fue escasa, indicador que pudiera estar influido por el pH ácido que ocasiona una baja asimilación del molibdeno (Martínez-Viera, 1986).

Se obtuvieron colonias con características morfológicas típicas para la familia Rhizobiaceae y se pudo comprobar su identidad como rizobios al producir nódulos en plántulas in vitro de M. atropurpureum, por su respuesta negativa a la tinción de Gram y poco o nulo crecimiento en PGA, resultados que coinciden con los de Somasegaran y Hoben (1994) y Drouin et al. (1996).
Estas aparecieron a los 3-5 días y presentaron diámetros de alta variación, donde predominó la formación de goma, característica reportada para Bradyrhizobium sp. (Arachis) por Mpepereki, Makonese y Wollum (1997) y por La Favre, Sinclair, La Favre y Eagleshman (1991) para bradyrizobios aislados de suelos nigerianos. Las cepas evaluadas mostraron, en general, una tasa de crecimiento, morfología y producción ácido-álcali características del género Brady-rhizobium (Graham et al., 1991). Todas produjeron ácido en ABT, lo cual está acorde con lo planteado por Sylvester-Bradley, Ayarza, Méndez y Moriones (1983) y Odee, Sutherland, Makatiani, McInroy y Sprent (1997) para Bradyrhizobium sp.

Las pruebas de tolerancia a factores abióticos mostraron que las cepas crecieron hasta pH 5. Sicardi de Mallorca e Izaguirre-Mayoral (1994) encontraron cepas de Bradyrhizobium sp. (Vigna) tolerantes a pH 4,5. Existieron cepas tolerantes a la vez a pH ácido y alcalino, lo cual coincide con investigaciones realizadas en Rhizobium leguminosarum (Helemish y El-Gammal, 1987). Dos cepas (C. virginianum y S. viscosa) toleraron hasta pH 11. Hamdi (1985) situó a los bradyrizobios entre los menos tolerantes a la alcalinidad, y Fernández y Novo (1988) afirmaron que no es común encontrarse un buen desarrollo de los rizobios en pH igual o mayor de 8. Somasegaran y Hoben (1994) plantearon que el crecimiento óptimo de los rizobios ocurre en pH 6-7. Otros autores, como Diatloff (citado por Bordeleau y Prévost, 1994), Park y Choi (1996) y Mpepereki et al. (1997), reportaron cepas de Brady-rhizobium sensibles a pH superior a 8.
Autores como Martínez-Viera (1986), Fernández y Novo (1988) y Somasegaran y Hoben (1994) proponen un rango de temperatura óptimo para los rizobios entre 20 y 31ºC. Iswaran, Sundara-Rao, Jauhri y Magu (1970), Munevar y Wollum (1981) y Osa-Afiana y Alexander (1982) plantearon que la tolerancia máxima de los bradyrizobios no sobrepasa los 33ºC, lo cual sugiere que este género, en general, posee un estrecho rango de tolerancia a temperaturas que excedan los 30ºC. Algunas de las cepas nativas estudiadas no coincidieron con el estándar fisiológico del género: 12 cepas aisladas (C. pubescens) crecieron a 40ºC. Esta variabilidad de las cepas pudiera responder a un proceso de adaptación natural debido a factores estresantes externos de forma continuada.
La tolerancia de algunas de las cepas nativas estudiadas al pH alcalino y a las altas temperaturas, no dependió del origen geográfico, de los factores edafoclimáticos ni del macrosimbionte. Es posible que se trate de una misma especie que muestra una amplia norma de reacción de su genotipo para adaptarse a las condiciones ambientales estresantes.
Las cepas mostraron una débil tolerancia a las dosis de NaCl aplicadas, lo que pudiera deberse a que los niveles de sales en el suelo muestreado no fueron suficientes para inducir mutaciones en las cepas que les permitieran tolerar la hipersalinidad.
Los niveles de diversidad genética difieren comúnmente de forma marcada entre especies (Martínez-Romero y Caballero-Mellado, 1996) y son muy variados los métodos por los cuales se puede estimar. El análisis del IGS en el ADN ribosómico 16S y 23S, amplificados por PCR, ofrece una gran confiabilidad para examinar cromosómicamente las variaciones genéticas codificadas en el nivel intraespecífico. Los espaciadores intergenómicos son segmentos de ADN que no se transcriben (Robertis y Robertis, 1986) y aunque pueden ser heterogéneos por el número variable de secuencias repetidas de los 15 pares de base, el análisis de éstos en el ADN 16S y 23S ribosómicos es una prueba de alta confiabilidad. Este análisis permitió situar las cepas de la zona sur en 5 grupos que pueden constituir, a su vez, genotipos diferentes. Se pudo observar, asimismo, que las cepas de referencia pertenecientes a Bradyrhizobium sp. se situaron en dos grupos de cepas nativas, mientras que las de B. japonicum no coincidieron con ninguna de éstas, por lo que se evidencia la cercanía de las cepas nativas a Bradyrhizobium sp. Estos datos coinciden con los de Bécquer, Prévost, Cloutier y Laguerre (2000), quienes detectaron 14 grupos IGS en cepas nativas de rizobios aislados de leguminosas forrajeras procedentes de la zona central de Sancti Spiritus, las cuales resultaron cercanas al género Bradyrhizobium.
Se concluye que tanto en las pruebas del fenotipo como en las del genotipo las cepas evaluadas se acercaron fisiológica y gené-ticamente al género Bradyrhizobium sp. Debe tenerse en cuenta algunos resultados de las pruebas de tolerancia a los factores abióticos, donde se mostraron caracteres no comunes a los reportados en este género, lo que pudiera significar la presencia de una nueva especie. No obstante, deben realizarse estudios fisiológicos y del genoma más profundos para llegar a conclusiones definitorias.

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Recibido el 5 de abril del 2000
Aceptado el 15 de diciembre del 2000