ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN
Estudio del comportamiento in vitro de Centrosema pubescens SN-82
Maribel Quintana, Lisbet Ulloa, J.A. Nápoles, A. Moles, A. Carbonell e Ivis Pasarón
Estación Experimental de Pastos y Forrajes de Sancti Spíritus. Sancti Spíritus, Cuba
RESUMEN
Con el objetivo de estudiar el comportamiento de la accesión Centrosema pubescens SN-82 ante la regeneración se probaron diversas dosis de citoquininas como: 6-BAP (6-bencilaminopurina) en concentraciones de 0,1; 0,3; 0,5; 1,0 y 2,0 mg/L y kinetina (0,1; 0,5 y 1,0 mg/L) y combinaciones de 6-BAP con ANA (ácido naftalenoacético) en concentraciones de 0,1; 0,5; 1,0 y 2,0 mg/L. Se observaron en todos los casos bajos potenciales regenerativos en esta especie, así como su carácter recalcitrante a la regeneración.
Palabras clave: Centrosema pubescens, cultivo de tejidos.
ABSTRACT
An investigation was conducted to study the behaviour of the accession of Centrosema pubescens SN-82 before regeneration. Several levels of cytokinins were tested such as: 6-BAP (6-benzylaminopurine) in doses of 0,1; 0,3; 0,5; 1,0 and 2,0 mg/L and kinetin (0,1; 0,5 and 1,0 mg/L) and combinations of 6-BAP and NAA (naphthalene acetic acid) in doses of 0,1; 0,5; 1,0 and 2,0 mg/L. Low regenerative potential in the studied species was observed, as well as its recalcitrant character to regeneration.
Additional index words: Centrosema pubescens, tissue culture.
INTRODUCCIÓN
El cultivo de tejidos vegetales es hoy una de las más poderosas herramientas al alcance del hombre, tanto para la propagación como en el mejoramiento de especies de interés. En las leguminosas estas técnicas son aplicadas fundamentalmente para los clones obtenidos en la mejora genética, así como cuando los resultados pueden alcanzarse en un corto período de tiempo (Mroginski y Kartha, 1984).
En la provincia Sancti Spíritus han sido recolectadas, en las prospecciones realizadas en las empresas ganaderas, un numeroso grupo de leguminosas naturalizadas en áreas que tienen diferentes carencias y deficiencias edafoclimáticas. No obstante, esta ventaja no puede ser aprovechada rápidamente, debido a que dichas plantas producen semillas una o dos veces al año y son de difícil recolección en su generalidad. Tampoco se cuenta con un área que las produzca, ya que no existe semilla para fomentarla; de ahí la importancia de la propagación de estos ecotipos.
En Cuba se ha empleado el cultivo de tejidos en Alysicarpus vaginalis (Hernández, Quintana, Ulloa, Nápoles y Moles, 1993), Macroptilium atropurpureum (Nápoles, 1995) y Vigna luteola (Quintana, 1995). Otros resultados en leguminosas han sido reportados por Mesa, Lajonchere y Prieto (1995) en dos cultivares de Leucaena leucocephala.
El Centrosema pubescens SN-82 rescatado por nuestro centro ha presentado características promisorias en su comportamiento, tanto para su uso en banco de proteína como en asociación con gramíneas, pero no existen semillas para su introducción a la producción; por ello, el objetivo en este trabajo fue estudiar el efecto de reguladores de crecimiento vegetal para la multiplicación de esta accesión.
MATERIALES Y MÉTODOS
Como fuente de material inicial se usaron plántulas de la accesión Centrosema pubescens SN-82, obtenidas de semillas germinadas in vitro, las cuales fueron suministradas por el banco de introducción de leguminosas prospectadas de la Estación Experimental de Pastos y Forrajes de Sancti Spíritus.
Las semillas fueron desinfectadas con agua y detergente, etanol al 70 % y una gota de Tween-20 durante 30", seguido de bicloruro de mercurio (0,1 %) en agitación continua por 20 minutos, y después se enjuagaron con agua destilada estéril cinco veces.
El medio basal para todos los experimentos fue el descrito por Murashige y Skoog (1962). Para su gelificación se usó agar (0,8 %) y se esterilizó en autoclave a 121°C y 1,2 kg/cm2 de presión. En todos los casos el pH se ajustó a 5,8 antes del autoclaveado; se emplearon tubos de ensayo (15,5 x 2,0 cm) a los que se les añadió 10 mL del medio.
Se utilizó una cámara de luz natural con 11 horas luz por día y la temperatura varió en un rango de 27±2°C. La manipulación vegetal se efectuó en una cabina de flujo laminar.
Para el procesamiento estadístico de los datos se empleó el análisis de varianza no paramétrico de Kruskall-Wallis y las diferencias se definieron a través del test de Mann-Whitney de comparación por parejas. Todo el proceso se realizó con el paquete SPSS/PC para Windows versión 5.0.
Efecto de ANA (ácido naftalenoacético) y 6-BAP (6-bencilaminopurina) en la inducción de regeneración
Como explantes se tomaron las yemas axilares y apicales de las plántulas a los 30-35 días posteriores a la siembra. Se dividieron las plántulas en esquejes de 1 cm aproximadamente; en todos los casos se eliminó la hoja y las yemas apicales se cortaron independientes del último nodo, excepto en los casos que fue imposible la separación.
El explante se colocó en el medio de cultivo y se mantuvo la polaridad a una profundidad no mayor de 2-3 mm durante un período de 30 días.
Las dosis de reguladores de crecimiento vegetal probadas para inducir la regeneración fueron las siguientes:
Las variables medidas fueron: regeneración (%), enraizamiento (%), formación de callos (%) y cantidad de yemas por planta a los 15 y 30 días posteriores a la siembra.
Efecto de diferentes dosis de 6-BAP combinado con ANA para estimular la regeneración
Tomando como referencia los resultados del experimento anterior se probaron dosis de 0,5; 1,0 y 2,0 mg de 6-BAP/L y 0,01 mg de ANA/L, mediante un procedimiento similar al descrito anteriormente.
Las variables medidas fueron: explantes que regeneraron vástagos (%), explantes que formaron callos (%) y cantidad de yemas por planta a los 15 y 30 días posteriores a la siembra.
Estudio de dos citoquininas en la regeneración
Se estudiaron dosis de 0,1; 0,5 y 1,0 mg de kinetina/L y 0,1 y 0,3 mg de 6-BAP/L y se utilizó el mismo procedimiento para mejorar la regeneración, tomando en cuenta los resultados de los experimentos anteriores.
Se evaluaron los explantes que regeneraron vástagos (%) y la cantidad de yemas por planta a los 15 y 30 días.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Efecto de ANA y 6-BAP en la inducción de regeneración
A diferencia de los resultados informados en otras leguminosas (Polanco, Peláez y Ruíz, 1988; McKently, Moore y Garder, 1989; Taji y Williams, 1989; Harry y Moore, 1990), en la accesión C. pubescens SN-82 el balance de auxina-citoquinina probado no mostró la respuesta esperada. El mejor comportamiento (tabla 1) se observó al emplear bajas concentraciones de la auxina o sin ella y la mejor combinación resultó 0,1 mg de ANA/L y 0,5 mg de 6-BAP/L, pero con porcentajes muy bajos de regeneración. Estos resultados también difieren de los obtenidos por Hernández et al. (1993) y Nápoles (1995). En la tabla 1 se observa que el 6-BAP inhibió marcadamente el enraizamiento.
Por otra parte, este comportamiento es común en las leguminosas, que por lo general son recalcitrantes al cultivo in vitro (Mroginski y Kartha, 1984; Narasimham, Rao y Rao, 1986; Eapen y George, 1990; Nagl, Ignacimuthu y Becker, 1997) precisamente por su resistencia a regenerar.
Efecto de diferentes dosis de 6-BAP combinado con ANA para estimular la regeneración
Considerando los resultados anteriores se probó aumentar las dosis de citoquininas, de acuerdo con lo recomendado por Litz y Jarret (1993), pero tampoco se observó una respuesta favorable (tabla 2) y los índices de regeneración disminuyeron con respecto al experimento anterior.
Estos resultados coinciden con los obtenidos en Vigna por Quintana (1995), en la que las combinaciones de reguladores de crecimiento empleadas no fueron efectivas para lograr la regeneración indirecta.
Estudio de dos citoquininas en la regeneración
Para ampliar el rango de citoquininas se probó con la kinetina, cuya acción es más fuerte que la del 6-BAP, y se emplearon dosis de 0,1 y 0,3 mg de 6-BAP/L con las que no se había trabajado anteriormente. En la tabla 3 se observa que estas dosis tampoco favorecieron la regeneración y la kinetina mostró la peor respuesta, lo que difiere de los resultados de Jain y Chopra (1988) y Cheema y Bawa (1991), quienes lograron una regeneración exitosa en otras leguminosas con el uso de la kinetina.
En este sentido, Mesa, A. (comunicación personal) informó que Teramnus labialis y Medicago sativa no mostraron resultados favorables para ninguno de los tratamientos probados durante más de 2 años en las condiciones de la EEPF "Indio Hatuey".
Se concluye que el 6-BAP inhibió la rizogénesis y no fue efectivo para inducir la regeneración en esta especie, el ANA tendió a inhibirla y el efecto de la kinetina no fue favorable.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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5. Jain, J. & Chopra, V.L. Genotipic differences in response to regeneration of in vitro cultures of moth bean Vigna aconitifolia (Jacq.) Marichal. Indian J. Exp. Biol. 29:654. 1988
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11. Nagl, W.; Ignacimuthu, S. & Becker, J. Genetic engineering and regeneration of Phaseolus and Vigna. State of the art and new attempts. J. Plant Physiol. 150:625. 1997
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15. Quintana, Maribel. Cultivo in vitro en Vigna luteola SC-123. Tesis en opción al título de Magister Scientiae en Biotecnología Vegetal. Universidad Central de Las Villas. Villa Clara, Cuba. p. 4. 1995
16. Taji, A.M. & Williams, R.R. In vitro propagation of Clianthus formosus (Sturt's desert pea) on Australian nature legume. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 16:61. 1989
Recibido el 15 de diciembre de 1998
Aceptado el 10 de agosto de 1999
